牛IFNT基因之特性分析及TEAD和YAP1基因对其表达之影响

来源: www.sblunwen.com 作者:lgg 发布时间:2013-10-11 19:58 论文字数:38900字
论文编号: sb201310101559408739 论文地区:中国 论文语言:中文 论文类型:硕士毕业论文 论文价格: 150
本研究在前人研究的基础上,进一步分析牛 IFNT 蛋白不同亚型结构及功能差异,并从牛 IFNT 基因的启动子区域分析入手,研究了 TEAD 家族及 YAP1 对 IFNT 基因表达的调控作用并对其潜在的调控区域

1 前 言


妊娠的成功与否,直接决定着动物种群的扩增与延续。 对于畜牧动物来说,妊娠是否成功直接决定着畜牧业的发展。 反刍动物妊娠的建立,从受精卵开始,当受精卵从输卵管进入子宫后,已发育至囊胚阶段。 此时,囊胚需要向母体发送信号,告知母体它的存在,母体子宫接到囊胚的信号后产生相应的反应,分泌胚胎生长发育所需的大量因子,调节子宫局部免疫系统,为胚胎的附植做好准备。 只有当胚胎顺利附植在母体子宫后,才能保证胚胎的进一步正常发育。 母胎间的这种交流是妊娠成功建立的必须条件,反之,妊娠的失败也多由这一过程异常所致。据联合国粮农组织 2009 年公布的统计资料显示:我国生猪存栏 5.23 亿头,占世界存栏总数的 50.9%,居世界第 1 位;绵羊 2.19 亿只,占世界存栏总数的 18.72%,居世界第 1 位;山羊 2.46 亿只,占世界存栏总数的 25.14%,居世界第 1 位;牛 1.89 亿头,占世界存栏总数的 9.2%,居世界第 3 位。肉类总产量达 10845 万吨,禽蛋(不含鸡蛋)843.6 万吨,鸡蛋 3578.6万吨,奶类 3785 万吨,其中肉类产量占世界总产量的百分之三十,禽蛋产量占百分之八十,鸡蛋产量占百分之四十,奶类产量占百分之五。以上的数据表明:畜牧业已经成为我国农业和农村经济中最有活力的增长点和最主要的支柱产业。 然而,我国的畜牧业发展,还存在着许多不足和需要正视的问题。反刍动物妊娠成功率低是世界上普遍存在的问题,也是阻碍反刍动物生产发展的重要原因。 有研究表明,尽管反刍动物的受精成功率在 90-100%,但高达 50%的妊娠以失败告终,成功分娩率只有 55%。牛妊娠失败中 70-80%发生于人工授精后的 8-16 天,即胚胎附植前期,涉及胚胎的早期发育、母体对妊娠识别等一些列重要的生理过程[1,2]。 随着体外受精、胚胎移植及克隆技术的应用,妊娠成功率虽有所提高,但仍处于较低水平[3],还远未达到提高家畜繁殖率的标准。 并且,胚胎移植并不能从根本上解决妊娠成功率低的问题,决定妊娠成败的关键是妊娠的建立过程。 对胚胎附植期间,母胎间相互作用的研究,将成为解决反刍动物繁殖率低下的重要课题。


1.1 母体对妊娠的识别
母体对妊娠的识别涉及正常的发情周期、黄体退化机制以及胚胎的发育等一系列重要的生理过程。在此期间,早期胚胎必须及时提供生物学信号给母体系统,以表明其在子宫中的出现,并通过阻止黄体溶解或提高黄体功能,维持母体血液中孕酮在较高水平,进而使妊娠得以维持[4]。灵长类动物和马的胚胎滋养层,通过分泌具有促黄体功能的绒毛膜促性腺激素,来保证黄体功能并维持孕酮的分泌[5];猪类主要通过滋养层分泌的具有抗黄体溶解功能的雌激素来维持黄体功能[6];干扰素-tau(interferon-tau)是反刍动物启动母体妊娠识别的关键因子[7]。此外,有研究表明在母体妊娠识别期间发生的胚胎死亡与 IFNT 具有重要关系[8]。


1.1.1 正常发情周期
当雌性动物性成熟后,正常情况下,在其繁殖期间都要经历发情周期。正常的发情周期包括两个主要阶段:卵泡期和黄体期。卵泡期从黄体(corpus luteun ,CL)退化开始至下次排卵。在这一阶段,初级卵泡逐渐成长为优势卵泡,并分泌雌激素(estradiol,E2)。黄体期由排卵开始,至黄体退化。在这一阶段,黄体是主要的卵巢结构,孕酮(progesterone,P4)是这一阶段的主要激素。发情周期中子宫内膜的基因表达变化主要由卵泡雌激素和黄体孕酮通过他们在子宫细胞上的受体调控。


1.1.2 黄体退化机制
家畜是自发排卵动物,其自发排卵主要通过子宫依赖方式,来控制黄体的寿命以及发情周期[9],因为子宫是黄体溶解素-前列腺素 F2α(PGF2α)的来源。未妊娠的牛羊,子宫内膜会在催产素的诱导下脉冲式释放 PGF2α,PGF2α通过局部对流交换机制被转运到卵巢,进而导致黄体结构和功能的退化[10]。启动黄体退化的 PGF2α 来源于子宫腔上皮细胞(endometrial luminal epithelium,LE)和表层腺上皮细胞(superficial glandular epithelium,sGE)[11],因为这些细胞表达催产素受体(Oxytocin Receptors,OXTR)[12],并且是唯一表达环氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)的子宫细胞,COX-2 是前列腺素合成的限速酶[13,14]。黄体退化是 P4、E2和催产素(Oxytocin,OXT)共同作用的结果。以绵羊为例,在发情当天(Day 0),囊状卵泡(Graafian follicles)产生的 E2刺激子宫内膜表达雌激素受体α(estrogen receptor α,ESR1)、孕酮受体(progesteronereceptor,PR)和 OXTR[15,16]。但此时并没有 PGF 分泌,因为产生催产素的黄体还没有形成。在发情间期的早期,新形成的黄体产生的孕酮刺激磷脂在 LE 和 sGE 细胞中累积,磷脂可以解放花生四烯酸,用于 PGF 的合成和分泌[17]。在发情间期,孕酮一直保持在较高水平,并通过其受体阻断 ESR1 和 OXTR 在子宫内膜 LE 和 sGE 细胞上的表达[18]。因此,在发情周期的第 5 到 11 天,即发情间期的大部分时间,检测不到 ESR1 和 OXTR。孕酮抑制 ESR1 基因表达的确切分子机制目前尚不清楚。但有研究表明,孕酮抑制 OXTR 基因表达可能是通过抑制ESR1 基因间接实现的[19]。子宫持续处于孕酮作用下 8 到 10 天,子宫内膜 LE 和 sGE 细胞上PR 的表达会下调[20],因此在发情周期的 11 到 12 天,没有了孕酮的抑制作用,ESR1 的表达迅速升高,随后在第 14 天,OXTR 的表达也迅速升高[21]。催产素在发情周期或妊娠的第 9天由垂体后叶和/或黄体分泌,并于第 14 到 16 天与其受体结合,诱导 PGF2α由子宫内膜 LE和 sGE 细胞脉冲式释放[12],进而导致黄体退化,绵羊完成了 17 天的发情周期,并进入下一发情周期。


2 材料与方法


2.1 试验材料
2.1.1 实验动物样品
本试验中所用的动物样品为日本黑毛和牛和荷斯坦母牛。试验中涉及的所有动物操作都经过东京大学和 Zen-noh 公司胚胎移植中心的实验动物委员会认可。 同期发情、超数排卵及胚胎移植如 Ideta[224]文章中所述。 首先对日本黑毛和牛进行超数排卵及人工受精, 收集妊娠第七天的胚胎(Day0=发情当天)。 将收集到的 12 个胚胎通过非外科手段移植至处于发情期第 7 天的 3 头荷斯坦母牛的子宫角内(n=4 each)。将处于伸长期的妊娠第 17、20、22天胚胎通过非外科的子宫冲洗方式获得。子宫冲洗后胚胎,1000rpm 离心 5 分钟,速冻保存。用外科手段取荷斯坦母牛各器官:心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、肌肉、皮肤、胎盘、乳腺,速冻保存,并送往东京大学动物繁殖育种实验室待检。


3 结果与分析 ..... 28
3.1 IFNT 蛋白对子宫内膜细胞影响的研究.... 28
3.2 TEAD 和 YAP1 对牛 IFNTc1 基因表达的调节 ..... 32
3.2.1 牛胚胎及各脏器中 TEAD 家族.... 32
3.2.2 Real-time PCR 测定牛胚胎中 TEAD 家族.... 34
3.2.3 荧光酶分析法检测 TEAD 家族.... 35
4 讨 论 .......41
4.1 牛 IFNT1 蛋白和 IFNTc1 蛋白结构和功能分析 ........ 41
4.2 TEAD 家族和 YAP1 对 IFNT 基因表达的调控 .... 42
4.3 IFNT 的生物学特性 .... 44


结论


1. 本试验研究了牛 IFNT 蛋白的两个不同亚型 IFNT1 和 IFNTc1 的功能差异,IFNTc1 可诱导 MX2 基因在牛子宫内膜上皮细胞表达,但是 IFNT1 不具备此功能。
2. 通过研究同源基因蛋白 IFNT1 和 IFNTc1 的结构差异,发现 IFNTc1 蛋白具有酪蛋白激酶区域(CK2 区域)而 IFNT1 不具有,将 IFNT1 基因突变使 IFNT1 蛋白具有 CK2 区域后,IFNT1 也具备了诱导 MX2 基因在子宫内膜上皮细胞表达的功能。
3. 系统的检测了 YAP1 基因和 TEAD 家族基因在牛胚胎及个器官中的表达情况。 研究发现除了 TEAD2 在各器官中表达极少外,其余基因都可在牛胚胎及个器官中表达;并且 YAP1、TEAD1、TEAD2、TEAD4 在附植后牛胚胎中表达显著升高。
4.研究结果表明 YAP1 可上调 IFNTc1 基因的表达,但其上调作用并不受 IFNTc1 基因 5’端上游区域切除或点突变的影响。说明其并不直接结合于 IFNTc1 基因 5’端上游区域。
5.研究了 TEAD 家族基因对 IFNTc1 基因表达的影响,结果表明 TEAD4 对-631-IFNTc1报告基因的表达有显著的上调作用,并且 TEAD4 的作用区间可能是 IFNTc1 基因 5’端上游区域 631 碱基到 383 碱基之间。


参考文献
[1] Diskin MG, Murphy JJ and Sreenan JM.Embryo http://sblunwen.com/jygc/ survival in dairy cows managed underpastoral conditions[J].Anim Reprod Sci,2006,96:297-311.
[2] Diskin MG , Morris DG . Embryonic and early foetal losses in cattle and otherruminants[J].Reprod Domest Anim,2008,43 Suppl2:260-7.
[3]Gregory L.Ovarian markers of implantation potential in assisted reproduction[J]. HumReprod,1998,13 Suppl 4:117-32.
[4] Bazer FW, Thatcher WW, Hansen PJ, et al. Physiological mechanisms of pregnancyrecognition in ruminants[J].J Reprod Fertil Suppl,1991,43:39-47.
[5] Hearn JP,Webley GE,Gidley-Baird AA. Chorionic gonadotrophin and embryo-maternalrecognition during the peri-implantation period in primates[J]. J Reprod Fertil, 1991, 92(2):497-509.
[6] Bazer FW,Thatcher WW.Theory of maternal recognition of pregnancy in swine based onestrogen controlled endocrine versus exocrine secretion of prostaglandin F2alpha by theuterine endometrium[J]. Prostaglandins,1977,14(2):397-400.
[7] Godkin JD,Bazer FW,Moffatt J,et al.Purification and properties of a major,low molecularweight protein released by the trophoblast of sheep blastocysts at day 13-21[J].J ReprodFertil,1982,65(1):141-50.
[8] Thatcher WW,Staples CR & Danet-Desnoyers G. Embryo health and mortality in sheep andcattle[J].Journal of Animal Science,1994,72:16–30.
[9] Spencer TE and Bazer FW. Conceptus signals for establishment and maintenance ofpregnancy[J]. Reprod Biol Endocrinol,2004,2:49.
[10] Ginther OJ, Araujo RR, Palhao MP,et al.Necessity of sequential pulses of prostaglandinF2 alpha for complete physiologic luteolysis in cattle[J]. Biol Reprod, 2009, 80:641–648.


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