丝素蛋白/纳米羟基磷灰石/透明质酸复合支架的制备及性能思考

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论文字数:33326 论文编号:sb2021100819144038671 日期:2021-10-16 来源:硕博论文网
本文是一篇临床医学论文,本研究以 SF、nHAp 和 HA 为原料,采用共混、交联、冷冻干燥等方法制备出SF/nHAp、SF/nHAp/1.5wt%HA、SF/nHAp/2.5wt%HA、SF/nHAp/5.0wt%HA 和SF/nHAp/7.5wt%HA 五组多孔复合支架,探讨了材料的组分与结构对材料性能的影响。采用 SEM、XRD、FT-IR、XPS 孔径、水溶性实验、膨胀率、吸水率、力学性能及降解实验对该支架进行了表征;

第一部分  SF/nHAp/HA 多孔支架的制备及性能表征

1   材料与方法
1.1 材料及仪器
1.1.1 实验原材料
蚕丝,购自江苏省鼎盛丝绸有限公司;等级:6A,细度:20/22D
纳米羟基磷灰石,纯度 97%(罗恩试剂,中国)
透明质酸,(罗恩试剂,中国)
1.1.2 实验试剂及耗材
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(Aladdin,中国) N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(Aladdin,中国) 无菌 PBS  (博士德,中国) 再生纤维素管式透析袋,截流量:14000,宽度:4 cm(联合碳化,美国) 15 ml, 50 ml 离心管(Nest,中国) 各规格移液枪,移液枪头(Corning, 美国) 抽滤瓶;不同毫升烧杯和量筒;玻璃棒,玻璃皿,滤纸(Bomex,中国)
1.1.3 实验仪器
电子天平 JT1003 集热式恒温加热磁力搅拌器 DF-101D(英峪予华,中国) 数控超声波清洗机 KQ-400DB(英裕予华,中国) 超纯水仪 Advantage A10(Milli-Q,法国) 低速离心机 Sorvall ST 16(赛默飞世尔科技,中国) 冷冻干燥机 FD-1A-50(博医康,中国) 恒温鼓风干燥箱 ZXRD-B5055(上海智城分析仪器,中国) 热场发射扫描电镜 JSM-7900F(日本电子,日本) 万能力学试验机 Instron3344(英朗斯特,美国)
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1.2 实验方法
1.2.1 丝素溶液的制备
1)脱胶:称取适量蚕丝置于 0.05wt%的 Na2CO3 溶液中,在沸水中处理三次,每次 30 min,以至完全脱胶。用去离子水冲洗残留在蚕丝表面的丝胶,之后放入 60℃的恒温箱内烘干备用。
2)溶解:将配制 CaCl2·CH3CH2OH·H2O(摩尔比 1:2:8)三元溶液加热至 72℃,把烘干且拉松的丝素纤维按照水浴比 1:10 加入溶液中搅拌,至完全溶解。 3)透析:将冷却的丝素蛋白-三元溶液共混溶液装入再生纤维素管式透析袋中。在去离子水中透析 72 h,每隔 2 h 换一次水。之后把透析得到纯 SF 溶液纱布过滤,1000 转/分离心后,保存于 4℃冰箱备用。
4)浓缩:将透析好的 SF 溶液置于 60℃恒温箱中浓缩,得到浓度为 5-8 wt%的再生丝素溶液。
5)浓度测定:  将称量皿放入 50℃烘箱中干燥 30 min,取出后称量,记录称量皿质量为 W(0g),用移液抢吸取 3 ml 浓缩后的丝素溶液,置于称量皿中,记录质量为 W1(g),之后置于 105℃烘箱内加热干燥,至玻璃皿内容物余留质量不变时取出称重,记录此时的重量为 W2(g)。依据浓度测定公式(1-1),求取 SF 溶液的浓度。 
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2   结果
2.1 多孔支架材料的大体形貌
制 备 好 的 SF/nHAp 、 SF/nHAp/1.5wt%HA 、 SF/nHAp/2.5wt%HA 、SF/nHAp/5.0wt%HA 和 SF/nHAp/7.5wt%HA 多孔支架材料呈白色的泡沫状固体,质地均一,表面粗糙,不光滑。肉眼可见各个面及剖面的网状空隙,触之质软,有弹性、韧性(见图 1-1 所示)。
图 1-1   多孔支架材料的外观
图 1-1   多孔支架材料的外观
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2.2 多孔支架的微观形貌
从图 1-2 中可以看出,复合多孔支架中 SF、nHAp、HA 之间没有明显的相分离,表明这三种组分之间具有良好的相容性。所有不同比例的复合多孔支架都具有多孔结构,且孔壁表面分布着许多小孔,这些小孔对物质之间的交换、细胞向材料内部生长、毛细血管网的快速长入、氧气以及营养物质的输送都是非常有益的。孔的大小和形状随共混比例的不同而变化(图 1-2(a2-e2))。首先,根据之前的文献研究,与单组分 SF 支架光滑的孔壁表面相比,复合支架的孔壁表面因加入 nHAp 后变得粗糙;其次,随着 HA 含量的增加,孔隙整体形状没有明显变化,但平均孔径减小,孔隙表面变得粗糙。
1-2  多孔支架 SEM 图 (A 和 B)
1-2  多孔支架 SEM 图 (A 和 B) 
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3   讨论 ............................... 31
4   小结 .......................................... 32

第三部分  总结与展望 ............................. 33 

3   讨论
支架材料具有良好的细胞相容性对组织工程来说至关重要。细胞-支架材料需要良好的连通性和合适的孔径来实现细胞迁移和物质代谢,并为组织再生提供支持和诱导。
为了进一步分析 SF/nHAp/HA 复合多孔支架的生物相容性,将 BMSCs 接种在不同 HA 含量的多孔支架上,采用 SEM 观察细胞在各组支架表面和内部的粘附和形态分布情况;基于活细胞(绿色标记)和死细胞(红色标记)染色,采用 LSCM 表征细胞-支架复合体中的细胞活力情况;共培养 1 d、3 d、7 d 后,用 CCK-8 试验定量检测不同支架上细胞活力和增殖情况。
总体而言,  SEM 图像、LSCM 图像和 CCK-8 分析表明,在 HA 含量保持在一定范围内的情况下,与 SF/nHAp 相比,SF/nHAp/HA 复合材料具有更好的生物相容性。该结果与先前证实的 HA 促进细胞增殖的研究一致。此外,有研究报道过高含量的HA 对细胞粘附和增殖具有一定的抑制作用[31]。然而,其他 HA 的含量还需要进一步研究。在本研究中,在 SF 中引入 HA 可以一定程度上模拟天然组织的微环境。一方面,三维网络结构有利于营养物质的输送和代谢产物的输出,从而为细胞生长提供了接近生理环境的微环境。另一方面,由于 HA 分子中存在大量亲水基团,使材料的亲水性和保水能力得到改善,能够与细胞表面的受体 CD44 结合,从而有利于细胞粘附和增殖。
其中,骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有分化为成骨细胞等多种细胞类型的潜能,其存在于骨髓、脂肪组织、脐带血和松质骨等多种组织中。由于其高增殖能力,其在体外扩增后,可以直接进行细胞移植或种植于生物材料上,植入机体修复组织缺损。
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第三部分  总结与展望

1 总结
本研究以 SF、nHAp 和 HA 为原料,采用共混、交联、冷冻干燥等方法制备出SF/nHAp、SF/nHAp/1.5wt%HA、SF/nHAp/2.5wt%HA、SF/nHAp/5.0wt%HA 和SF/nHAp/7.5wt%HA 五组多孔复合支架,探讨了材料的组分与结构对材料性能的影响。采用 SEM、XRD、FT-IR、XPS 孔径、水溶性实验、膨胀率、吸水率、力学性能及降解实验对该支架进行了表征;利用 LSCM、SEM 和 CCK-8 法来检测 BMSCs在复合支架上的增殖情况,评价其细胞相容性;此外,还采用 BMSCs 开展体外成骨诱导分化实验,通过检测 ALP 活性及钙沉积情况来评价其促成骨分化能力。主要研究结果如下:
1. nHAp 和 HA 同时加入 SF 基多孔支架中,复合支架的孔壁表面因加入变得粗糙;随着 HA 含量的增加,材料孔径和降解速率降低,孔隙率、膨胀率、吸水率和力学性能均增大,
2. LSCM、SEM 和 CCK-8 法检测表明,SF/nHAp、SF/nHAp/1.5wt%HA、SF/nHAp/2.5wt%HA、SF/nHAp/5.0wt%HA 和 SF/nHAp/7.5wt%HA 五组多孔复合支架都表现出良好的细胞相容性,其中,SF/nHAp/5.0wt%HA 多孔复合支架的促进细胞增殖能力显著高于其他四组。
3.  在 BMSCs 的成骨诱导分化中,SF/nHAp/5.0wt%HA 复合材料刺激 ALP 分泌和矿物沉积作用强于 SF/nHAp、SF/nHAp/1.5wt%HA、SF/nHAp/2.5wt%HA 和SF/nHAp/7.5wt%HA 多孔支架,表明 SF/nHAp/5.0wt%HA 多孔复合支架在骨缺损修复中具有良好的应用前景。 
参考文献(略)

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