2型糖尿病伴牙周炎患者唾液及血液代谢组与转录组联合分析

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论文字数:52125 论文编号:sb2021102118582338985 日期:2021-11-07 来源:硕博论文网
本文是一篇临床医学论文,对人类唾液的全面分析,在病理生理状态的研究、生物标志物的发现,特别是在疾病诊断领域有很大的影响。并为确认人类疾病的潜在生物标记物提供基础,这些优势已确保广泛使用唾液作为诊断工具在临床进行实践。这一领域的未来将依赖于对疾病特异性生物标记物的进一步验证,并将其纳入最先进的分析方法中,这种方法是定量、特异性的、快速可靠的,敏感且经济有效的,以便在诊断项目中广泛实施。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂
表 1 主要实验试剂
表 1 主要实验试剂
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1.2 主要实验仪器及耗材
表 2 主要实验仪器及耗材
表 2 主要实验仪器及耗材
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2 结果

2.1 唾液代谢组结果分析
2.1.1 数据质控
代谢组具有易受外界因素干扰且变化迅速的特点,因此,数据质量控制(Quality Control,QC)是获得稳定性和准确性的代谢组结果的必要步骤。尤其是当样本量大的时候,样品上机检测需要一定的时间,代谢物检测过程中仪器的稳定性、信号响应强度是否正常就显得尤为重要。质控能够及时发现异常情况,以保证最终数据的质量。基于代谢物的相对定量值来计算 QC 样本之间的 pearson相关系数[25],QC 样本相关性越高体现在图上就是 R2 越接近于 1,说明检测的整个过程稳定性越好,数据质量越高。唾液 QC 样本相关性见图 1,如图所示,各 QC 样本之间相关性均大于 0.98,说明本次试验整个过程中仪器及数据采集稳定。
图 1 唾液样本 QC 样本相关性得分图
图 1 唾液样本 QC 样本相关性得分图
2.1.2 主成分分析(PCA)
主成分分析(Principal component analysis, PCA)是将一组可能存在相关性的变量,通过正交变换转换为一组线性不相关变量的统计方法,转换后的这组变量即称为主成分。代谢组数据可以被认为是一个多元数据集, PCA 则可以将代谢物变量按一定的权重通过线性组合进行降维,然后产生新的特征变量,通过主成分的相似性对其进行归类,从总体上反映各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小。将所有实验样本和 QC 样本提取得到的峰,经经 UV 尺度化(Univariate scaling,单变量标准化)处理后进行 PCA 分析。将所有实验样本和 QC 样本提取得到的峰,经经 UV 尺度化(Univariate scaling,单变量标准化)处理后进行 PCA 分析。QC 样本差异越小说明整个方法稳定性越好,得到的数据质量也就越高,在 PCA 分析图上显示 QC 样本的分布会聚集在一起,组内试验样本聚集越近说明组内样本之间重复性越好,组间样本之间聚集越远说明组间差异越大。如图 2 所示,本实验通过 PCA 可区分各组样本,同时 QC 样本紧密聚集,也再次验证本次试验数据的稳定可靠。
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2.2 血浆代谢组学结果分析
2.2.1 数据质控
如图 7 所示,血浆样本中的 QC 样本相关性均趋近于 1,表示本试验整个过程中仪器及数据采集稳定。
图 7 血浆 QC 样本相关性得分图
图 7 血浆 QC 样本相关性得分图

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3 讨论...........................15
4 结论...........................25


3 讨论


牙周炎和糖尿病是高度流行的慢性非传染性疾病,对世界各地人口的公共卫生构成重大挑战。在牙周炎被描述为糖尿病的“第六并发症”之后,我们认识到这两种疾病之间的联系要比这复杂得多,而且有明确的证据表明,糖尿病和牙周炎之间存在双向关系,两者都对对方产生负面影响,糖尿病患者患牙周炎的风险是正常人的 2-3 倍,血糖控制水平是决定风险的关键[30]。与糖尿病的其他并发症类似,血糖控制越差,牙周炎的风险越高[31]。牙周组织发炎,进入循环系统,导致全身炎症反应加重,而炎症导致胰岛素信号受损和胰岛素抵抗,从而加重糖尿病,糖化血红蛋白(HbA1c)水平的升高反过来又会增加糖尿病并发症(包括牙周炎)的风险,从而产生疾病之间的双向关系[32]。
糖尿病和牙周炎因为是慢性炎症疾病,通常在发现时已对组织造成损害,这时寻找一种可以对疾病具有高度敏感的生物标志物显得尤为迫切。近年来,国内外对唾液作为生物诊断物研究为我们打开了新的思路,虽然龈沟液比唾液更能代表牙周的局部炎症情况,但因糖尿病是全身炎症性疾病,目前在诊断上主要是通过血液检测,且血液和唾液关系密切,唾液同样可以反映口腔微环境,采集唾液样本的优势包括整体成本更低,感染风险更低,增加了患者的方便性、可接受性、依从性和摄取性,并且血液中某些成分同样也可在唾液内检出,血液和唾液可一起用于研究疾病发病机制等,所以用唾液作为样本来进行实验是具有优势且可行的。随着科学技术不断的发展,代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后出现的新兴组学技术,是系统生物学的重要组成部分。代谢组学旨在考察生物体系(细胞、组织等)受到刺激或扰动后,其代谢产物的变化或随时间规律发生的变化,通过筛选实验组与对照组的差异代谢物,研究差异代谢物参与的生物过程,揭示其参与的生命活动机制,是转录组学和蛋白质组学的延伸,能够更直接、更准确地反映生物体的生理状态[33]。非靶向代谢组学(Untargetedmetabolomics)以发现为目的,需尽可能多地检测到生物样本中的代谢物,最大程度反映总的代谢物信息,超高效液相色谱(UHPLC)与高分辨质谱联用,即液质联用(LC-MS/MS)技术,由于其检测物质范围广、前处理简单等优势,在非靶向代谢组学研究中应用越来越广。
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4 结论


(1)收集 4 组患者唾液、血浆进行非靶代谢组学检测,最终筛选出共有差异代谢物二十二碳六烯酸、花生四烯酸、神经酸、LPE 22:4 及 LPC18:1,上述 5 种代谢物或许可在临床上使用唾液检测进行牙周炎诊断的生物标志物,其中神经酸、LPE 22:4 及 LPC18:1 是糖尿病伴牙周炎的特征代谢物,此 3 种物质可成为使用唾液检测替代血液检测诊断糖尿病伴随牙周炎的特异性物质。
(2)收集 4 组患者唾液、血浆进行非靶代谢组学检测,最终筛选出共有的通路有甘油磷脂代谢,不饱和脂肪酸的生物合成,癌症中的胆碱代谢,维生素的消化吸收,精氨酸和脯氨酸代谢,为后续研究疾病发病机制研究奠定了基础。
(3)通过全血转录组发现了 marker 基因 ACTO2。ACTO2 可作为血液中的基因标志物。这些特征性代谢物和 marker 基因在相关疾病的早期预防、临床诊断、治疗及预后等方面都体现了潜在的应用价值;针对筛选出来的共有通路以及上游的调控基因,为后续研究其具体调控机制做铺垫。
(4)本实验的研究结果为日后临床以唾液样本为研究对象,应用多组学的研究手段对疾病进行早期辅助诊断、监控和预后提供了初步的实验依据。
 


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