EIF3B在舌鳞状细胞癌中的表达及其功能探讨

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论文字数:36566 论文编号:sb2021121312374340936 日期:2021-12-14 来源:硕博论文网
本文是一篇临床医学论文,在本研究中,通过CCK-8法验证敲降EIF3B使CAL 27细胞系的增殖降低;平板克隆实验验证敲降EIF3B使CAL 27克隆形成能力降低。

第一部分   人舌鳞状细胞癌和癌旁组织测序分析材料与方法

1  材料
1.1  临床标本收集
由福建医科大学附属第一医院伦理委员会审核批准,在患者知情同意的情况下,在福建医科大学附属第一医院收集2017年9月至2020年9月人舌鳞状细胞癌患者癌及癌旁标本共38对。所有组织标本均在术后10 min内取癌和癌旁组织,并立即转移储存至液氮中备用。
TSCC病例收集纳入标准为:(1)经手术取得组织标本,经病理或细胞学检查确诊为口腔鳞状细胞癌;(2)均为原发性口腔癌的新发病例(术前未经过放疗、化疗治疗);(3)年龄在30-80岁之间;(4)临床病理资料完整者;(5)能提供知情同意书。
病例排除标准:(1)合并其他恶性肿瘤者或第二原发或为远处转移;(3)严重的全身性疾病或感染者;(3)经病理或细胞学确诊为口腔炎症、良性病变、继发肿瘤及病情危重不能清晰回答问题者。
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2  方法
2.1  基于DIA技术的舌鳞状细胞癌全蛋白组测序分析
将收集到的舌鳞状细胞癌患者的肿瘤标本及癌旁组织送至深圳华大基因股份有限公司进行舌鳞状细胞癌全蛋白组测序及数据生信分析。
2.2  寻找测序数据差异基因
测序结果共得到20个样本5862个蛋白的表达矩阵;删除在50%的样本中表达水平为NA的蛋白共得到4322个蛋白;使用R软件包impute进行缺失值插补;使用R软件包limma进行分位数标准化;加权基因共表达网络WGCNA进行构建权重共表达网络,首先对样本进行聚类,选择软阈值β  =  5,构建无尺度网络。下一步将表达矩阵转换成邻接矩阵,然后再将邻接矩阵转换成拓扑矩阵,基于TOM,我们使用average-linkage  层次聚类法对基因进行聚类,按照混合动态剪切树的标准,并设置每个基因网络模块最少的基因数目30。在使用动态剪切法在确定基因模块后,我们依次计算每个模块的特征向量值,然后对模块进行聚类分析,将距离较近的模块合并成新的模块,设置  height=0.25、deepSplit = 4、minModuleSize = 30。共得到了11个模块;我们分别计算了这11个模块的特征向量与Case和Control的相关性;根据模块的特征向量我们分别计算了每个模块中的基因与模块的相关性;导出每个模块之间的互作网络。
2.3  构建蛋白相互作用网络
利用STRING数据库(https://string-db.org)11.0版本进行蛋白相互作用分析:(1)在Multiple  proteins中输入差异蛋白名称;(2)确定物种名称,进入下一步;(3)点击MAPPING以Excel格式下载所输入的蛋白的详细信息。
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第二部分  EIF3B在人舌鳞状细胞癌及癌旁标本的验证材料与方法

1  材料
1.1  临床标本收集
临床标本收集纳入及排除标准同第一部分。
1.2  主要试剂
临床医学论文参考
临床医学论文参考
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2  方法
2.1   qRT-PCR技术
2.1.1  舌鳞状细胞癌及癌旁组织RNA提取
(1)样本的处理将取得约50 mg癌和癌旁标本用无酶刀片切碎,放入研磨管中,用电动匀浆机将组织彻底匀浆,然后加入10 μL蛋白酶K,混匀后室温放置5 min
(2)12000 rpm离心5 min,取上清;
(3)将的到的上清加入基因组DNA去除柱中,12000 rpm离心30 s,保留滤液;
(4)向上述滤液中缓慢加入1倍体积上清液体液的70%乙醇,混匀,将得到的溶液和沉淀一起转入RNase-Free吸附柱CR4中,12000 rpm离心30 s,弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中;
(5)向RNase-Free吸附柱CR4中加入700 μL去蛋白RW3,12000 rpm离心30 s,弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中;
  (6)向RNase-Free吸附柱CR4中加入500 μL漂洗液RW,室温静置2 min,12000 rpm离心60 s,弃废液,将吸附柱放回收集管中;
(7)重复步骤6;
(8)12000 rpm离心2 min,倒掉废液,将RNase-Free吸附柱CR4置于室温放置2 min,彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液;
(9)将RNase-Free吸附柱CR4转入下一个新的RNase-Free离心管中,向吸附膜中间部位悬空滴加50 μLRNase-Free ddH2O,室温放置2 min,12000 rpm离心2 min,得到RNA溶液;
(10)取2 μL所得RNA,于紫外分光光度计下检测OD260、OD280及其比值,确定RNA的浓度及纯度。
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第三部分   EIF3B 体外功能实验及机制研究.......................30
1.1  材料......................................30
1.2  方法.................................................31
1.3  结果.................................................39
1.4  讨论...................................................... 45
1.5  小结.................................................47
结论...............................48

讨论
蛋白质合成的调节主要在合其成起始阶段,通过对蛋白质合成的调节从而对基因表达进行快速、可逆和空间控制[44]。EIF3 是最大、最复杂的起始因子,EIF3包含 13 个亚基(EIF3a-m),其中 a,b,c,e,f 和 h 亚基是 EIF3 的功能核心[45]。几乎所有蛋白质合成的都有 EIF3 参与,而重要的是参与该过程的起始步骤,主要功能包括核糖体三元复合物的募集、经与 EIF4G 的相互作用将 43S 复合物附着于mRNA 上、防止 40S 和 60 S 核糖体亚单位的过早结合、选择起始密码子 AUG[8, 46, 47]。EIF3 其主要生理功能就是通过各亚基之间及与其他蛋白质之间相互当 EIF3 各亚基之间的表达失调时,就有可能导致机体出现疾病或者使原有疾病加重,其主要与肿瘤、神经退行性疾病、感染等疾病相关[48]。翻译控制是癌症发展和进展的关键组成部分,肿瘤细胞的生存活、血管生成、转化、侵袭和转移等都与蛋白的翻译相关[49, 50]。而 EIF3B 是 EIF3 的关键亚单位,是 EIF3 的一种支架蛋白,在 EIF3中发挥重要作用,其生理功能和细胞的蛋白翻译、细胞生长相关,在肿瘤中,主要通过影响肿瘤的分期、分化、侵袭和转移[23]。
在本研究中,通过CCK-8法验证敲降EIF3B使CAL 27细胞系的增殖降低;平板克隆实验验证敲降EIF3B使CAL 27克隆形成能力降低。因此可以得出EIF3B对舌癌的生长和增值具有促进作用,这与EIF3B在全身肿瘤的研究结果相似,如:EIF3B能促进胰腺癌的发生发展,在胰腺癌细胞系中敲减EIF3B,使细胞细胞周期停滞和自发诱导凋亡[25];TEX9和EIF3B协同促进ESCC的进展,并通过激活AKT信号通路刺激肿瘤生长[51];沉默EIF3B使骨肉瘤细胞系的增殖受到抑制[52];EIF3B通过调节C3G的表达来调节慢性粒细胞白血病细胞系的细胞增殖和凋亡过程[24];抑制EIF3B的表达,能使胶质母细胞瘤的细胞周期停滞在G0 / G1期,从而影响细胞的增殖[53]等。虽然关于EIF3B促进多种肿瘤的增殖作用有许多报道,但其功能作用还尚未明确,有待行更深层次的研究,以填补研究空白。
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结论


本研究结论如下: 1. EIF3B 在 TSCC 癌组织中的表达高于癌旁组织。 2. EIF3B 对 TSCC 细胞的增殖、迁移和侵袭有促进作用。 3. EIF3B 能影响 TSCC 细胞的 EMT 过程。
参考文献(略)