枯草芽孢杆菌抗菌物质的制备及其在水产保鲜上的推广

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论文字数:38856 论文编号:sb2021100222511638550 日期:2021-10-11 来源:硕博论文网
本文是一篇农业论文,本文对菌株的发酵产物进行了初步鉴定,为抗菌物质的开发提供了新的菌株,获得了优化的固态发酵工艺,提高了发酵产量,对抗菌物质的工业化生产具有借鉴意义。此外,初步探索了枯草芽孢杆菌发酵产物对水产品腐败细菌的抑菌作用,为其在水产品防腐保鲜中的应用提供了新的技术思路。

1 前言

1.1 枯草芽孢杆菌简介
枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属,革兰氏阳性菌,其菌体呈杆状[1],其具有较强的繁殖能力,对营养物质的需求不高[2]。枯草芽孢杆菌的生长速度快,发酵成本低,且能够产生多种次级代谢产物,是抗菌物质的重要来源[3]。枯草芽孢杆菌所产物质大多为脂肽类化合物,该类物质的抗菌范围广,抑菌能力强且不易产生耐药性。研究表明,抗菌脂肽类化合物通常是由脂肪酸链与肽链组成的,它们的分子结构呈特殊的环状,其脂肪酸结构异构体的差异,使其能够形成 300 多种不同的类型[4]。
目前,已知的脂肽类化合物主要包括:伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)以及达托霉素(daptomycin)[5]等成分,而枯草芽孢杆菌所产抗菌物质中研究较为深入的是Surfactin。Surfactin是由一条多肽链跟脂肪酸链结合形成的,其中多肽链包含四个亮氨酸、一个缬氨酸、一个谷氨酸和一个天冬氨酸共七个氨基酸,脂肪酸链是含有十二个至十七个碳原子的 β-羟基脂肪酸[6]。surfactin 具体结构如图 1-1 所示[7]。
图 1.1  表面活性素分子结构示意图
图 1.1  表面活性素分子结构示意图
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1.2 枯草芽孢杆菌发酵产物
1.2.1 抗菌脂肽的应用
抗菌脂肽类化合物较强的抑菌活性和亲水亲脂的特性,使其在众多领域开始广泛应用,并在农业、畜牧业、水产养殖业、食品保鲜、石油开采等方面有着广阔的市场前景。
在食品防腐保鲜的方面,抗菌脂肽类物质可以作为新型生物保鲜剂得到广泛应用。任莉[10]等人将纳豆菌抗菌脂肽添加到鸡饲料中,通过研究其成分对肉鸡屠宰性能和肉品品质的影响,得出纳豆菌抗菌脂肽添加到饲料中对肉鸡的屠宰性能不会产生显著影响,但是可以改善肉鸡的肉品品质,获得优质的肉产品。此外,在食品保鲜方面,王东[11]等人将抗菌脂肽 APNT-6 用于抑制对虾中的腐败细菌,发现其对虾肉中的主要腐败细菌能够起到良好的抑菌效果,并且在抗菌脂肽溶液处理后,虾肉腐败变质过程中的 pH 变化、含氮物质的分解状况和腐败细菌的增长都受到抑制,其货架期相比较能够延长了 2~3 d。这为延长水产品的货架期,解决水产品保鲜过程中滥用抗生素、化学保鲜剂等问题提供了新的解决思路。
随着养殖业的发展,抗菌脂肽类物质在该领域的应用研究变得越来越广泛。为研究不同水平的抗菌脂肽物质能否对鸡肉的抗氧化能力起到帮助,都海明[12]等人在喂鸡饲料中添加了不同剂量的抗菌脂肽,发现使用含有抗菌脂肽类物质的饲料喂养,可以增加鸡肉的抗氧化能力并提高蛋白质的代谢水平。此外,在海水养殖及人工水产养殖过程中,致病菌往往会导致海水养殖动物致病,引起水产动物患病或死亡,造成巨大损失。而抗菌脂肽类物质作为一种健康安全的抑菌物质替代品,可以杀灭动物饲料中多数的致病菌,还可以通过消化系统进入动物体内对肠道病原菌进行有效抑制。另一方面,抗菌脂肽类化合物在进入动物体内后,可以通过正常的代谢作用进行有效分解,不会影响动物的正常生长,也不会残留于动物体内,从而避免影响肉产品的品质,是一类安全高效的饲料添加剂。
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2 枯草芽孢杆菌抗菌物质的制备及初步鉴定

2.1 实验材料与设备
2.1.1 主要仪器
目前,已知的枯草芽孢杆菌发酵产物的鉴定结果表明,其发酵产物中的抑菌成分一般是表面活性素(surfactin)、芬荠素(fengycin)以及伊枯草菌素(iturin)等物质[66]。这些具有抑菌活性的发酵产物被称为抗菌脂肽,它们通常是由脂肪酸链与肽链组成的,分子结构呈特殊的环状,其脂肪酸结构异构体的差异,使其能够形成 300 多种不同的类型[4]。
本实验通过盐酸沉淀、超滤、SepHadex LH-20 凝胶过滤层析、LC-MS 分析等方式对菌株发酵液进行初步的分离纯化和鉴定。
表 1 主要仪器与试剂
表 1 主要仪器与试剂
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2.2 实验方法
2.2.1 培养基制备
LB 液体培养基:蛋白胨 10.0 g/L、酵母提取物 5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L,调节液体培养基 pH 7.2~7.5,121 ℃高压灭菌 20 min。   LB 固体培养基:在液体发酵培养基基础上加 2 %的琼脂。
2.2.2.种子液制备
用无菌接种环挑取菌株的单菌落划线至 LB 固体培养基上,30 ℃条件下培养活化 24 h 后将菌落接种液体培养基,于恒温摇床 30 ℃、180 r/min 条件下培养14 h,即为种子液。
2.2.3 发酵产物的制备
参考钱常娣对枯草芽孢杆菌发酵产物进行提取的方法[8],并进行一定的修改,将菌株 M252 的种子液以 1 %的接种量转接至 LB 液体发酵培养基中,于恒温摇床 30 ℃、180 r/min 条件下培养 48 h。然后,将发酵液在 4 ℃、9000 r/min 条件下,离心 15 min,并使用 6 mol/L HCl 调节上清液的 pH 至 2.0,将上清液在 4 ℃条件下过夜沉淀,再将发酵液离心 9000 r/min、15 min 并收集沉淀。将沉淀物用适量的甲醇溶解,并用 1 mol/L NaOH 调节 pH 至 7.0,磁力搅拌 4 h,再次离心并弃沉淀,将发酵液经旋转蒸发、真空冷冻干燥 48 h 后制得粗提物,称重并记录。
2.2.4 产物的初步分离及鉴定
将所提取的发酵产物,用甲醇溶解,将发酵产物溶液注入超滤管上层,将超滤离心管放置于高速冷冻离心机中,在 4 ℃、5000 r/min 条件下离心 2 h,收集上、下层溶液,分别对上、下层发酵溶液进行抑菌试验,确定分离成分是否具有抑菌活性,并再次进行旋转蒸发和冷冻干燥。
抑菌方法:采用滤纸片法进行实验,以筛选出的腐败细菌希瓦氏菌作为指示菌,首先在培养皿中倒入 20 ml 左右的 LB 固体培养基,混合均匀,待培养基静置凝固后,加入 100 μL 的菌浓度为 105~106   CFU/mL 的菌悬液,涂布均匀,在培养基上均匀地放置滤纸片,将分离的上层溶液 25 μL 和 35 μL 分别滴至滤纸片上,将培养皿放在 30 ℃的恒温培养箱中培养 36 h 后,通过观察是否具有抑菌圈,确定抑菌性。
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3 固态发酵条件的优化 ........................................ 19
3.1 材料和仪器 ................................................. 19
3.1.1 主要材料 .......................................... 19
3.1.2 主要仪器 ............................. 19
4 抗菌物质对腐败细菌的抑制作用 ................................. 32
4.1 材料与仪器 ........................................ 32
4.1.1 实验材料 .................................................. 32
4.2 实验方法 ...................................... 33
5 抗菌物质在水产保鲜上的应用 .......................................... 45
5.1 材料与设备 ................................... 45
5.2 实验方法 .................................. 45

5 抗菌物质在水产保鲜上的应用

5.1 材料与设备
目前,枯草芽孢杆菌所产抗菌物质已经被证明是一种较为安全高效的生物保鲜剂,代替抗生素类药物,对致病菌进行预防和杀灭,有效避免细菌产生抗药性。
本章采用浸渍的方式处理海青虾,在 4 ℃的恒温箱中贮存,以 pH、挥发性盐基氮(TVB-N 值)、菌落总数为指标,探究其在提高水产货架期及防腐方面的效果,以期为枯草芽孢杆菌抗菌物质在海产品贮藏保鲜中的应用提供理论基础。
表 5-1 主要试剂与仪器
表 5-1 主要试剂与仪器
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6 结论与展望

6.1 结论
1.  通过 LB 液态发酵方式获得枯草芽孢杆菌 M252 的发酵产物,经分离纯化、质谱分析,初步推测获得的发酵产物中的抑菌物质为脂肽类化合物 surfactin,并通过单因素实验和响应面优化获得最优的固态发酵工艺组合。
2.  探究了抗菌物质对腐败菌的抑制作用,获得抗菌物质对两株腐败细菌的最小抑菌浓度为 20 mg/mL,抗菌物质能有效清除腐败细菌的生物被膜,并能通过破坏细胞膜的方式,有效抑制两株腐败细菌的生长。 
3.  探究了虾肉冷藏过程中 pH、TVB-N、菌落总数的变化,得出抗菌物质处理虾肉后能够提高虾肉冷藏货架期 2-3 d,其能够有效抑制水产品中腐败细菌的生长繁殖,减缓腐败细菌对其蛋白质等含氮物质的分解,对水产防腐保鲜起到一定的作用。
参考文献(略)