阿魏酸低聚糖对肌原纤维蛋白结构和功能特性的调控机理研究

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论文字数:42555 论文编号:sb2021101611212038821 日期:2021-10-25 来源:硕博论文网
本文是一篇农业论文,通过本研究发现,阿魏酸低聚糖对氧化肌原纤维蛋白具有调控作用,不同添加量的阿魏酸低聚糖对肌原纤维蛋白的结构性质与凝胶特性影响不同,但阿魏酸低聚糖对肌原纤维蛋白的氧化调控结合位点尚不明确,在今后的研究中,可以进一步通过高分辨率质谱检测加合物的酶解和水解产物,分析阿魏酸低聚糖与肌原纤维蛋白的加合产物和加合位点,阐明阿魏酰基和低聚糖基团的贡献作用,从而明确阿魏酰低聚糖强化肌原纤维蛋白凝胶特性的核心路径与机理,并将其应用于产品中。

第一章  前言

1.1  肌原纤维蛋白
1.1.1  肌原纤维蛋白概述
肌肉中的蛋白质主要包括:肌原纤维蛋白(Myofibrillar protein,MP,盐溶性,60%)、肌浆蛋白(水溶性,35%)和基质蛋白(不溶,5%)[1]。肌原纤维蛋白可以在适当的加工条件下加热形成良好的三维凝胶结构,因此其不仅决定着加工肉制品的弹性、咀嚼性和多汁性等质构特征,还影响着肉制品的储藏期和稳定性。
肌动蛋白(actin)和肌球蛋白(myosin)是肌原纤维蛋白中的主要成分,占肌原纤维蛋白总量的 70%以上[2],二者对加工肉制品品质和功能特性有重要影响。蛋白质的功能性质主要分为:蛋白质-水、蛋白质-脂肪、蛋白质-蛋白质的相互作用。肌原纤维蛋白的功能特性及其在食品工业中的应用主要受加工条件的影响,例如离子强度、pH、温度和其他成分的添加。 通常,肌原纤维蛋白与水的相互作用会影响其功能特性,例如溶解度、保水性和粘度[3]。溶解度是 MP 最常见的功能特性之一,一方面,溶解度主要取决于蛋白质表面疏水和亲水氨基酸的分布以及蛋白质和水分子的相互作用[4]。另一方面,盐的浓度、盐的类型、pH和温度在影响肌原纤维蛋白溶解度方面起着关键作用。研究人员提出,溶解度的变化主要受肌球蛋白的影响[5]。在离子强度较高的缓冲液中(> 0.3 M),肌球蛋白丝易被分解为肌球蛋白单体,溶解度增加,当离子强度降低(<0.3 M)时,单体形式可重新聚集成丝,溶解度减少[6]。据报道,氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)溶液会影响肌原纤维蛋白的溶解度[7]。中性盐的存在改变了肌原纤维蛋白分子之间的静电相互作用,并增加了蛋白的溶解性(盐溶作用)[4]。特别的是,肌原纤维蛋白分子在其等电点处没有静电荷,大多数蛋白分子倾向于缔合形成聚集体[3],因此肌原纤维蛋白的溶解度在等电点附近(pH 5.5)较低,当 pH 大于或小于等电点时,蛋白质携带更多的电荷,盐溶作用增强,有利于肌原纤维蛋白溶解度的增加。
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1.2肌原纤维蛋白氧化机制及其影响研究
肉类食品包含所有必需氨基酸,其组成特征与人体肌肉的组成特征非常相似,因此具有很高的营养价值。同时,肌肉蛋白质通过赋予特定的功能(胶凝,乳化,水合等),极大地促进了肉和肉制品的整体特性,包括质地,外观,口感以及稳定性。但是肌肉蛋白在宰后加工、运输、储藏等各个生产环节中都极易被氧化,致使肉制品的营养成分被分解、破坏。蛋白质氧化修饰以及脂质氧化和微生物变化是致使肉制品质量下降的关键因素。
蛋白氧化的机制根据氧化途径不同可分为两种:一种是蛋白质与活性氧(ROS)或活性氮(RNS)等直接反应,另一种是蛋白与以醛类物质为代表的脂类次级氧化产物反应[20-22]。新鲜肉的肌原纤维蛋白对由 ROS 引发的氧化反应高度敏感,氧化反应发生时,O2 的两个电子可以分别还原形成超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2),最终生成氧化能力最强的羟自由基(•OH),从而引发蛋白质、脂质和核酸的氧化损伤。脂类氧化会生成醛类物质(丙二醛,羟基壬烯醛和丙烯醛等),它们可以与蛋白质残基发生共价结合,导致蛋白质氧化[23, 24]。此外,活性氧可以通过将生物体暴露于外源性物质,包括紫外线,辐射,化学试剂(金属离子如 Fe2+、Cu+、HONOO、臭氧、N2O2),药物及其代谢产物等[25]使蛋白受到氧化。
蛋白氧化可导致蛋白质结构的改变,肽链的裂解,氨基酸侧链的修饰以及蛋白质衍生物形成引起的分子间交联[26]。氧化攻击可以改变蛋白质结构,细胞骨架蛋白的氧化大部分由活性自由基氧化剂产生的•OH 引起[27],该反应在氨基酸残基的 α-C 位点发生,和 O2反应生成烷基过氧自由基。这些过氧自由基反应生成氢过氧化物或亚胺,亚胺的水解可导致蛋白骨架断裂[28]。此外,ROS 经由 β-断裂反应可产生羰基化合物[29]。半胱氨酸和蛋氨酸易被各种形式的 ROS 氧化修饰生成巯基。暴露在表面的氨基酸残基更易被氧化,但似乎对蛋白质构象没有显着影响[30],而内部氨基酸残基氧化则导致蛋白质解折叠及构象变化[31]。例如,酪氨酸磷酸酶催化半胱氨酸 252 的氧化可导致该蛋白的其他氨基酸残基和 P 环的构象发生变化[32]。关于氧化蛋白降解诱导酶的敏感性仍然存在一些争论。一般而言,蛋白酶的消化率会因过度氧化蛋白的聚集而降低,但却不会影响适度氧化蛋白的酶消化率[32]。蛋白质疏水区中蛋氨酸的氧化极有可能改变蛋白质的结构。在肌动蛋白中,氯胺-T 诱导的蛋氨酸氧化改变了其构象,增加了其表面疏水性。掩埋的蛋氨酸的氧化会破坏肌动蛋白内的非共价相互作用,并降低肌动蛋白的稳定性[33]。
图 1-1  阿魏酸低聚糖的结构
图 1-1  阿魏酸低聚糖的结构
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第二章  羟自由基体系对肌原纤维蛋白结构性质及凝胶特性的影响研究

2.1  引言
蛋白氧化被认为是一种与脂肪氧化类似的自由基链式反应。蛋白氧化无处不在,可以通过活性物(ROS)直接诱导,或通过来自氢过氧自由基、羟自由基[62]、血红蛋白自由基[37]或者脂质二级氧化产物[63]等氧化次级产物引发,调控氧化程度稳定肌原纤维蛋白的结构特性和强化肌原纤维蛋白的凝胶特性是目前研究的热点。
本试验主要研究H2O2产生的羟自由基为自由基中间体,并作用于肌原纤维蛋白,研究不同氧化程度下(0.05~10 mM H2O2)蛋白结构的变化、蛋白结构特性的改变以及 MP 热诱导凝胶特性的影响,分析热诱导凝胶形成过程中的流变学特性、凝胶强度和持水性的变化,探究蛋白氧化修饰对肌原纤维蛋白结构、性质和凝胶特性的影响。 
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2.2 实验材料与仪器设备
新鲜猪肉背长肌(Longissimus dorsi)取自屠宰 2 天内的猪,购于北京市物美超市。剔除可见脂肪组织后切丁,真空密封分装,置于-20 ℃贮藏备用。
实验主要试剂
实验主要试剂

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第三章  阿魏酸低聚糖对氧化肌原纤维蛋白性质和结构影响研究 ....................... 26
3.1  引言 .................................................. 26
3.2  实验材料与仪器设备 .................................. 26
第四章  阿魏酸低聚糖对氧化肌原纤维蛋白凝胶性质和稳定性的影响研究 ....... 41
4.1  引言 ......................................... 41
4.2  实验材料与仪器设备 .................................... 41
结论与展望 ...................................... 54
结论 .............................................. 54
创新点 ........................................... 55

第四章  阿魏酸低聚糖对氧化肌原纤维蛋白凝胶性质和稳定性的影响研究

4.1  引言
肌原纤维蛋白是肌肉蛋白中形成凝胶必不可少的因素,赋予肉制品尤其是肉糜制品良好的质地和口感。凝胶特性是肉制品加工过程中最重要的功能特性,包括质构变化、保水性、流变特性等。肌原纤维蛋白的凝胶特性受到内因:主要有肌球蛋白、肌动蛋白、肌肉种类和来源等;外因:包括 pH、离子强度、加热速率、外来添加物、氧化诱导等多种因素的影响,其中通过调控氧化程度和添加外来物质强化肌原纤维蛋白的凝胶特性是目前研究的热点。多酚类化合物氧化后形成的醌类物质可能会引起 MP 中巯基向二硫键的转化,也可能与蛋白质侧链的巯基、自由氨基等亲核基团共价结合,这些变化可能会影响 MP 的凝胶性。研究表明,将多酚类化合物添加到肉糜制品中,蛋白质与其之间的非共价和共价相互作用会影响蛋白凝胶稳定性。因此,研究多酚类物质与肌原纤维蛋白的凝胶强化机制对肉制品加工具有重要意义。
本章实验建立•OH-肌原纤维蛋白氧化体系,添加不同浓度 FOs 制备热诱导凝胶,通过测定凝胶特性的相关指标,研究凝胶体系中 FOs 的添加对氧化肌原纤维蛋白凝胶特性的影响,分析维持蛋白凝胶特性的化学作用力的变化。
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结论


(1)不同浓度•OH 处理对猪肉肌原纤维蛋白的功能特性有显著影响。随着 H2O2浓度升高,羰基化合物生成,酪氨酸被氧化成二酪氨酸后聚合,半胱氨酸分解,巯基含量下降。当 H2O2浓度为 1 mM 时,蛋白交联程度提高,结构稳定,易形成包裹油滴的稳定界面,乳化活性最优。过度氧化使氨基酸残基发生修饰,蛋白结构打开,内部疏水基团暴露,表面疏水性显著增加,溶解度和乳化性下降。随着 H2O2浓度的提高,肌原纤维蛋白凝胶特性的改善效果显著,适度氧化浓度下(1 mM)下,有利于肌原纤维蛋白凝胶交联成可溶性聚集体,增强凝胶结构与水结合的能力,显著增强凝胶强度(粘性)和持水性(弹性),过度氧化使得蛋白分子间疏水作用增强,蛋白过度交联,凝胶结构被破坏,不利于凝胶体系的形成,凝胶强度和持水性显著下降。
(2)建立•OH-肌原纤维蛋白氧化体系,研究阿魏酸低聚糖对肌原纤维蛋白氧化程度、蛋白质性质和结构的影响。研究发现,添加适量的阿魏酸低聚糖显著提高了MP 的抗氧化性,适量的阿魏酸低聚糖可以有效保护肌原纤维蛋白结构,抑制蛋白羰基和自由氨基含量的增加,使蛋白溶液体系趋于稳定,降低表面疏水性,增加蛋白的溶解度,提高蛋白巯基和 α-螺旋结构的含量、增强色氨酸荧光和热稳定性;随着阿魏酸低聚糖浓度的增大,阿魏酸低聚糖与蛋白质游离氨基发生结合,形成不溶性蛋白-醌聚集物,溶解度下降,且过量的阿魏酸低聚糖引入极性羟基和羧基基团,导致蛋白结构不稳定。通过电泳分析,过量的阿魏酸低聚糖通过二硫键与肌原纤维蛋白结合,形成分离胶顶部的不溶性聚合物,导致蛋白分子粒径增大,溶液体系不稳定。
参考文献(略)


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