产β-葡萄糖苷酶的微生物的筛选鉴定及其在人参皂苷C-K转化中的推广

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论文字数:45565 论文编号:sb2021102720102839185 日期:2021-11-06 来源:硕博论文网
本文是一篇农业论文,本研究通过对于筛选的两株菌株 DNA 的提取,扩增 16s  rDNA 后送至测序公司测序,得到的序列进行拼接,将拼接好的序列与 NCBI 数据库收录的菌株序列进行Blast 分析,并构建分子进化树。结果发现 S’4 菌与菌株 Dyella  jiangningensis SBZ3-12 最为相似,相似度为 100 %。S’6 菌与菌株 Cohnella thermotolerans CCUG 47242 最为相似,相似度为 100 %。

1  绪论

1.1 西洋参简介
市面上常见的西洋参成品为五加科植物西洋参根部干燥后形成的干燥根,美国、加拿大等西方国家为其原产地,又名:花旗参、洋参[1] 。其根部可入药,外形与人参相似,内部的活性物质的含量和种类与人参有所区别。清朝时期在中国有了较多应用,《本草从新》和《本草拾遗》也有记载。我国在二十世纪八十年代引进种植西洋参,已经形成东北地区,北京地区和山东半岛为主的种植区,经过多年的发展,中国成为西洋参第一大消费国和仅次于美国的第二大生产国[2]。人参和西洋参在药理方面作用有所差别,中医理论上两种人参有寒温之异。人参性属温热,能够减轻由体内寒气所导致的病症,具有温里散寒、温经通络气等功效,而西洋参性属寒凉,能够减轻因内火燥热所导致的病症,具有消热去火、消毒生津等功效[3]。
1.1.1 西洋参的化学成分
人参皂苷是西洋参中主要成分,是发挥其药理功能的主要活性成分。1854年美国学者 Garrigues 由西洋参中分离得到一种未知物质,受限于当时的科技水平,没有确切的分析其作用。Sanda 将在西洋参中提取的活性成分成为人参皂苷Rx,并根据薄层层析的 Rf 值不同,命名为 Rbl,Rb2,Rc,Ro,Ra,Rd,Re,Rgl,Rg2,Rg3 和 Rh2[4-6]。此后,世界各地的学者从西洋参和人参的分离发现发现的其他类型的人参皂苷,如人参皂苷 F1,、F2、F3、F4、25-羟基-人参皂苷-Rg2 等[7-11]。
除了人参皂苷以外,西洋参还含有其他成分,如挥发油、有机酸、黄酮类、木脂素,糖类、氨基酸等物质[12-16]。
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1.2 人参皂苷的结构与分类
人参皂苷由苷元和糖基两部分组成,属于三萜类皂苷。根据苷元的结构不同可以分为达玛烷型,齐墩果烷型,奥克梯隆型三种[17]。其中达玛烷型根据所含有的羟基不同又分为原人参二醇型人参皂苷和原人参三醇型人参皂苷[18]。
1.2.1 原人参二醇型人参皂苷
原人参二醇型人参皂苷根据苷元的手性碳原子旋光异构不同可分为20(S)-和  20(R)-原人参二醇型人参皂苷。根据 C-3 和 C-20 位置上的糖基不同可以分为人参皂苷 Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc  和  Rd 等,分子结构如图1.1 和 1.2 所示。
图 1.1 20(S)-原人参二醇型人参皂苷
图 1.1 20(S)-原人参二醇型人参皂苷
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2  转化人参皂苷 Rb1 菌株的筛选

2.1  实验材料和仪器
2.1.1  实验材料
土壤取自文登西洋参种植园内,人参皂苷 Rb1、Rd、F2、CK 购自贵州华夏高科科技有限公司。
2.1.2  实验试剂 
表  2.1 实验试剂
表  2.1 实验试剂 
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2.2  实验方法
2.2.1  菌株的筛选
用 100 mL 量筒量取 90 mL 蒸馏水于 100 mL 锥形瓶中并封口,置于高压灭菌锅内,121  ℃灭菌 20  min 后取出冷却备用,天平称取西洋参根际土壤 10 g,放置于灭菌的蒸馏水内,充分震荡摇匀,制成 10-1浓度的土壤悬浊液。吸取该浓度的溶液 1 mL,将其加入至装有 9 mL 无菌蒸馏水的 15mL 离心管中,震荡使其混合均匀,得到浑浊的溶液即为 10-2浓度的土壤稀释液,按照这种方法将土壤悬浊液依次稀释成 10-3~10-7浓度备用。
2.2.2  菌株的初筛
2.2.2.1 R2A 固体培养基的制备
用天平称取 15.2 g R2A 培养基粉末,溶于 1000 mL 蒸馏水中,并用玻璃棒充分搅拌溶解,置于高压灭菌锅内 121  ℃,灭菌 20 min,取出晾至 40℃左右,在超净台分装至培养皿中,放置 4  ℃冰箱备用。
2.2.2.2 涂布土壤稀释液
预先开启超净台紫外 20  min 以上,在使用前喷洒 75%的酒精进行消毒,保证超净台处于无菌状态。用移液枪吸取 1  mL  土壤稀释液用涂布棒均匀涂布至R2A 固体培养基中,在 37  ℃培养箱倒置培养,每天观察记录培养状况。
2.2.3 菌株分离纯化
预先对超净台进行无菌处理,对涂布培养后的培养基上的形态、颜色等外在表观不同菌落进行标记,用接种环挑取少量单菌落划线至新 R2A 固体培养基,在 37  ℃培养箱倒置培养,尽量将所有外在形态有差异的菌落都挑选出来,尽可能没有遗漏。重复该步骤直至培养基上长出单菌落没有杂菌为止。菌落长出以后对不同菌株进行编号,放置 4  ℃冰箱备用。
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3 转化人参皂苷 Rb1 菌株的分类鉴定 .................................... 23
3.1  实验材料与仪器...................................... 23
3.1.1  实验材料 ...................................... 23
3.1.2  实验试剂 .............................................. 23
4 响应面法优化转化皂苷 Rb1 为 C-K 的反应条件 .............................. 31
4.1  实验材料与仪器........................................... 31
4.1.1  实验材料 ................................ 31
4.1.2  实验试剂 ................................................. 31
5 菌株转化人参皂苷 Rb1 为 C-K 路径的探究 ................................... 59
5.1  实验材料与仪器................................ 59
5.1.1  实验材料......................... 59
5.1.2  实验试剂.................................................... 59

5 菌株转化人参皂苷 Rb1 为 C-K 路径的探究

5.1  实验材料与仪器
5.1.1  实验材料
从文登西洋参种植园采集土壤中分离出来具有转化转化皂苷 Rb1 为皂苷C-K 的菌株 S’4 和 S’6。
5.1.2  实验试剂
表 5.1 实验试剂
表 5.1 实验试剂
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6  结论与展望

6.1  结论
人参皂苷作为西洋参中重要的药用成分,将西洋参中常量皂苷 Rb1 转化为稀有皂苷 C-K 具有重要实用价值。本研究从山东文登西洋参种植园采集的西洋参种植土壤中分离具有转化皂苷 Rb1 转化为稀有皂苷 C-K 的菌株,并通过对菌株进行分子生物学分类鉴定来确定菌株分类;通过单因素实验确定最佳转化条件区间,由响应面实验得出最优转化条件。具体实验结果如下:
1.菌株的筛选
从西洋参根际土壤样品中分离出 26 种菌株,通过 E-R2A 鉴定培养基的鉴定培养,发现其中有 13 种菌株可以分泌 β-葡萄糖苷酶,通过对这些菌株进行人参皂苷 Rb1的转化实验,并通过 TLC 检测转化结果,发现 S’4 和 S’6 两种菌株可以将人参皂苷 Rb1转化为稀有皂苷 C-K。
2.菌株的分子生物学鉴定
通过对于筛选的两株菌株 DNA 的提取,扩增 16s  rDNA 后送至测序公司测序,得到的序列进行拼接,将拼接好的序列与 NCBI 数据库收录的菌株序列进行Blast 分析,并构建分子进化树。结果发现 S’4 菌与菌株 Dyella  jiangningensis SBZ3-12 最为相似,相似度为 100 %。S’6 菌与菌株 Cohnella thermotolerans CCUG 47242 最为相似,相似度为 100 %。
3.菌株转化条件单因素实验
对两种菌株的转化温度,菌体浓度,转化 pH,转化时间进行单因素实验,为了控制菌体加入量由于人工操作造成的误差,故采用菌液在 600 nm 吸光度值来控制菌液浓度。实验结果表明,菌株 S’4 和 S’6 在 37℃时转化效率最高,且温度变化对其影响较小;菌株 S’4 最优转化 pH 区间为 5~6,菌株 S’6 最优转化 pH区间为 6~7;菌株 S’4 最优菌液浓度区间为 1×109 CFU/mL ~1.5×109 CFU/mL,菌株 S’6 最优菌液浓度区间为 6×108 CFU/mL  ~9×108 CFU/mL;菌株 S’4 最优转化时间区间为 6~8 天,菌株 S’6 最优转化时间区间为 6~8 天。
参考文献(略)