过氧化氢对白沙蒿种子萌发的影响

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论文字数:24525 论文编号:sb2021121312090640933 日期:2021-12-14 来源:硕博论文网
本文是一篇农业论文,本文对外源添加 H2O2、DPI 的白沙蒿种子萌发变化、种子活力、生理变化、生化变化进行了研究,并探讨了外源添加对白沙蒿萌发的生态意义。

第一章 绪论

1.1 引言
活性氧(Reactive oxygen species,ROS),是指经过氧分子单电子还原生成一些代谢物及衍生物,其中包括如O2-、•OH等自由基物质和H2O2、1O2等非自由基物质等(师瑞红等,2005)。植物进行有氧代谢时,产生大量ROS会导致脂类、蛋白、核酸等一些生物大分子发生氧化反应,从而影响植物正常的生长发育(李武,2010)。同时,H2O2(过氧化氢)作为一种重要信号分子,参与植物对生物和非生物胁迫响应,提高植物对外界逆境胁迫的适应性(Neill,2002)。
种子萌发是植物生命周期中最关键的阶段,影响着植物生长和生产力。植物种子在正常发育和贮藏中,其自身的有氧代谢导致产生活性氧,活性氧过量积累可损伤种子活力(Yin,2014)。H2O2作为影响植物体内活性氧平衡的主要物质,其含量的高低与种子活力密切相关(Xia,2015)。高浓度H2O2外源处理,可能会引起种子中营养物质的外渗、改变种子萌发过程中的代谢途径,从而会抑制种子萌发(何士敏等,2008)。H2O2被认为是重要的种子发芽促进剂,研究发现,添加适宜浓度H2O2,可打破大豆(Glycine max)和小麦(Triticum aestivum)种子的休眠,促进其萌发(He,2007;Zhang,1996);可提高木豆(Cajanus cajan)、油桐(Vernicia fordii )种子萌发过程中的抗旱和耐盐性(Ellouzi H,2017)。目前,外源H2O2处理对种子萌发的影响已在水稻(Oryza sativa)(Tan,1991)、大豆(何士敏等,2008)、小麦(Zhang,1996)等植物中有研究报道。外源H2O2对种子萌发的处理结果,是否受植物品类的影响,其作用机理仍有待进一步研究。
与油料作物油菜种子相比,白沙蒿(Artemisia sphaerocephala)种子在老化处理后受到的损伤更小,能更好的维持种子活力,比油菜种子更耐老化(张艳慧,2016);储藏过程中白沙蒿种子脂质过氧化程度较小,是其耐储藏的重要原因之一(段国琴,2018)。目前,白沙蒿种子活力与其H2O2含量的关系研究较少,因此,本试验以2018年采集白沙蒿种子为试验材料,探究外源H2O2添加与清除后,对白沙蒿种子萌发特性、生理变化的影响,对不同种类植物种子外源添加H2O2处理后,种子的萌发规律进一步加深理解,为系统地解释白沙蒿种子的萌发与H2O2之间的关系作进一步的研究。
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1.2 文献综述
1.2.1 活性氧
植物有氧代谢中部分氧气(O2)受氧化还原反应的影响,产生了活性较强的ROS,其中包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)和羟自由基(·OH)以及一氧化氮(NO)等。O2接受电子传递,形成O2-,植物在正常环境下,通过电子转移、光合作用等产生少量的O2(Halliwell and Gutteridge,1989;刘树森,2005)。O2-除了能自身歧化为H2O2,也能通过SOD的催化歧化产生H2O2(赵丽英等,2005)。H2O2为中性时,更具有稳定性,但因为其具有成对的电子,可以穿透生物质膜,对植物产生伤害(Halliwell and Gutteridge,1989)。所以,当H2O2的浓度较低时,其可作为ROS的信号传导分子,对生物特定的过程进行调控,或者当植物遭受到外界逆境胁迫时,可以参与介导,使植物对外界环境形成抗逆性(Neill and Desikan,2002)。而当H2O2的浓度较高时,植物中的半胱氨酸和甲硫氨酸的含硫基团可以被H2O2氧化,使植物在反应过程中一些酶失活。同时,H2O2也能氧化植物中的磷酸酶、蛋白激酶含硫醇基的转录因子,可以诱发植物细胞程序的进一步死亡(Moller et al.,2007;Kaiser,1979)。
过氧化氢酶(CAT)主要存在于细胞内的氧化物中,对H2O2的清除起重要作用,对H2O2的亲和性低,虽清除速度快,但对H2O2的作用有限。不过,对H2O2的亲和性高的,如APX等(林文洁和陈丽晖,1998)。此外,H2O2也能作为POD(过氧化物酶)的底物,其与O2ˉ反应形成·OH,而被清除(Haber-Weiss反应Halliwell and Gutteridge,1989)。而·OH是ROS中活性最高的,可以氧化植物中的多数物质分子,造成植物细胞的膜脂过氧化以及损伤蛋白等细胞。但是,植物细胞内清除·OH的酶促反应较为缺乏,因此,·OH的逐渐积累也可以造成植物细胞的损伤(苏立强,2016)。
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第二章 材料与方法

2.1试验处理
选择 H2O2 作为外源 ROS 供体,二苯基氯化碘盐(diphenyleneiodoniumchloride, DPI)作为抗氧化剂,清除内源性 H2O2。H2O2 工作液浓度分别配置为1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L、70 mmol/L、100mmol/L,DPI 工作液浓度分别配置为 10 μmol/L、25 μmol/L、100 μmol/L,以H2O 对照, 25℃下进行萌发实验。萌发过程中,每天将萌发进程中的种子转移至新鲜 H2O、相应浓度 H2O2 和 DPI 侵泡的滤纸上。萌发持续 7d,每天统计发芽数、计算发芽率,筛选外源添加 H2O2、DPI 最适浓度。后续实验在最佳处理浓度下,分别收集 24 h 和 48 h 后的吸胀未萌发种子,液氮速冻后,保存于-20℃冰箱用于相关指标的测定。
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2.2测定项目与方法
2.2.1种子萌发相关指标的测定
参照白沙蒿种子萌发标准(于浩然等, 1994; 黄振英等, 2001),采用培养皿纸上法,在 25℃光照培养箱(MLR-351H, Panasonic)中进行发芽实验。每皿随机 50 粒种子,设置 5 次重复。胚根突破种皮视为萌发,每 24 h 计数一次、计算发芽率,统计持续 7 天。同时观察并记录每个培养皿中第一粒种子萌发的天数,记为初始萌发时间。
发芽率(%)= 已萌发种子数/种子总数×100%;
2.2.2 种子相对电导率和丙二醛含量的测定
相对电导率:采用浸泡法(Diao et al., 2014)。种子清洗后,放置于试管中,加去离子水,在室温下浸泡 12h。用电导率仪测定,电导率 R1(沸水浴前),30 分钟后,冷却,测定电导率 R2,计算电导率。
MDA 含量:TBA 法(苍晶等, 2013)。称取 0.5g 种子至于研钵内,加入10 mL 10%(v/v)TCA 溶液,用石英砂研磨成匀浆,4000 rpm 下离心 10 min,吸取上清液进行测定。在试管中分别加入上清液、0.6%(w/v)TBA 各 2 mL,混匀,沸水浴中反应 15 min,冷却后离心,取上清液测定 450 nm、532 nm 及600 nm 下的 OD 值。
2.2.3 种子内源激素含量的测定
ABA(脱落酸)和 GA3(赤霉素)的含量测定参照 Yano(Yano et al., 2009)和 Saika 等人(Saika et al., 2007)的方法,使用 HPLC 分析仪测定。称取 0.5 g 种子,在冰浴研钵中研磨后,加入 1 mL 预冷的 80%甲醇(v/v),内含 1 mmol/LBHT(2,6-二叔丁基对甲苯酚),4℃条件下过夜浸提。8000 rpm 下离心 15 min,取上清液,再次加入 1 mL 甲醇,4℃条件下浸提 1 h,合并上清液并记录体积,用 C18 固相萃取柱纯化,过柱后样品用氮吹仪吹干。用样品稀释液溶解,储存待测。HPLC 液相条件:使用 Rigol L3000 的高效液相色谱仪(安捷伦 1100,U.S.A.),Kromasil C18 的反相色谱柱,进样量 10 μL,流速 0.8 mL/min,柱温35℃,波长 254 nm。
农业论文参考
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第三章 结果与分析................................. 17
3.1 添加 H2O2、DPI 最适浓度的筛选..............................17
3.2 添加 H2O2、DPI 后对种子发芽率的影响...........................18
3.3 添加 H2O2、DPI 后对白沙蒿种子细胞膜透性的影响..................................20
第四章 讨论...............30
4.1 添加 H2O2、DPI 后对白沙蒿种子萌发的影响...............................30
4.2 添加 H2O2、DPI 对白沙蒿种子膜透性的影响.........................30
4.3 添加 H2O2、DPI 后对白沙蒿种子内源激素含量的影响.............................31
第五章 结论与展望................................ 36
5.1 主要结论.........................................36
5.2 展望..................................36

第四章 讨论

4.1 添加H2O2、DPI后对白沙蒿种子萌发的影响
种子萌发阶段,是植物生命周期中最重要的阶段之一。种子萌发的有效进行决定了幼苗的正常发育和生长。对植物种子来说,发芽是一个非常复杂的过程,从吸水开始,涉及到静止干燥种子向代谢活性状态的转变。胚胎的出现被认为是种子发芽的最后阶段(Weitbrecht et al .,2011;Bewley et al.,2013)。种子活力是种子特性的综合表现,种子活力的高低,决定了种子在萌发过程中的活性水平(杜利霞等, 2005; El-Keblawy and Al-Rawai, 2006),而发芽率是表示种子活力的重要指标 (Pukacka et al., 2007)。目前研究发现,低浓度H2O2处理促进谷类植物种子萌发,但高浓度H2O2限制谷类植物种子萌发,如水稻(Oryza sativa L)(王艳玲,2017)、小麦(卢金,2012)和玉米(Zea mays L)(张秀英,2009)的种子。本研究中,低、高浓度H2O2对白沙蒿种子萌发的作用与其他物种有所差异:低浓度H2O2添加下,白沙蒿种子发芽率为31.6%,显著低于对照,说明低浓度H2O2对白沙蒿种子的萌发有一定的抑制作用,同时加入DPI后,发芽率为36.00%,低于对照,与单纯添加低浓度H2O2相比并无显著差异,但显著高于单纯添加DPI时的发芽率,说明H2O2复合DPI处理下,白沙蒿种子的萌发与对照相比依然受到抑制,但逆转了单独添加DPI对种子发芽率的抑制作用,高浓度H2O2处理下,白沙蒿种子发芽率为78.40%,显著高于对照,说明高浓度H2O2添加下,白沙蒿种子的萌发得到促进。但同时加入DPI后,发芽率显著下降,与单纯添加H2O2相比,高浓度H2O2对种子发芽率促进的趋势被逆转,但也同样解除了单独添加DPI对种子发芽率的抑制作用;而对白沙蒿种子单独添加DPI后,白沙蒿种子的发芽率为21.20%,且发芽率随DPI浓度的增加而降低,种子的萌发特性发生改变 ,说明DPI能够抑制白沙蒿种子的萌发。

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第五章 结论与展望

5.1 主要结论
(1)白沙蒿种子萌发受 H2O2 浓度的调控:低浓度 H2O2 抑制,高浓度 H2O2促进;DPI 清除内源 H2O2 显著抑制白沙蒿种子萌发,H2O2 复合 DPI 处理下,白沙蒿种子萌发率低于对照,表明内源性 H2O2 对其萌发过程具有重要作用。
(2)低浓度 H2O2 处理下,ABA 含量上升,GA3 含量下降,GA3/ABA 比值降低抑制种子萌发;高浓度 H2O2 处理下,ABA 含量下降,GA3 含量上升,GA33/ABA 比值升高促进种子萌发。
(3)低浓度 H2O2 处理下,白沙蒿种子 SOD、CAT、APX、GR 酶活性以及 AsA、GSH 抗氧化物质含量上升,H2O2 被清除,抑制种子萌发;高浓度 H2O2下,其抗氧化能力下降造成 H2O2 积累,促进了种子萌发。
参考文献(略)