两种药食两用赤小豆幼苗类黄酮与酚类物质含量及抗旱性差异探讨

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论文字数:28225 论文编号:sb2021101109080838709 日期:2021-10-14 来源:硕博论文网
本文是一篇药学论文,本试验只针对 XD13-12 和 XD15-03 为对象来开展,探讨 PEG 模拟的干旱胁迫对赤小豆幼苗叶片类黄酮及酚类物质含量和抗氧化能力的影响。后续研究可选用更多品系,进行盆栽及田间小区试验在赤小豆的整个生育期进行进一步研究验证。

第一章  文献综述

1.1 研究背景
严重的气候变化,造成包括干旱在内的多种非生物胁迫。其中干旱胁迫对作物的生长和产量的危害最为严重(Xue et al. 2014;Boyer 1982)。干旱半干旱地带在我国的土地面积中占了近一半。我国总耕地超过一半的面积属于没有灌溉条件的旱地。干旱严重制约着我国的农业生产(朱丽芳等 2017)。植物苗期受到干旱胁迫,地上和地下部分的生长均会收到抑制(张雁霞等 2015),对植物的生长和产量有非常严重的影响,有可能造成大面积的大面积烂种和死苗(刘丽琴等 2017)。因此,研究作物苗期的抗旱机制对于提高旱区耕地的利用率,增加粮食产量,保证粮食安全是极为重要的。
赤小豆(Vigna umbellata Ohwi et Ohashi)又名红小豆、小豆、赤豆,豆科豇豆属一年生半缠绕草本植物(金文林等 1991),一般呈赤色,形状为椭圆形或长椭圆形,是亚洲地区主要的豆类作物之一(张瑞益等 2019)。原产亚洲热带地区,起初在我国南部野生或栽培,现在我国南北方都有种植。我国的赤小豆栽培面积、生产量和出口量均为世界第一(牟善积 1992;Tomoka et al. 2003;彭游等 2013)。赤小豆是常用的传统中药材之一,始载于《神农本草经》 ,药用历史久远,是一种药食同源作物。赤小豆可以抗氧化、降血脂等。中医认为,赤小豆性平,有解毒排脓消肿利尿等功效(张元超等 2006;崔国静等 2014)。赤小豆含有蛋白质、淀粉和维生素等丰富的营养物质(王树安 1994;刘建霞等 2015)。近年来,赤小豆的生产量和出口量在不断增加,已成为国内外人们喜食的豆类之一。赤小豆生育期短,对土壤有很强的适应性,即使在酸性,微碱性土壤,轻度盐碱地也能生长(连慧达 2015;李茉莉等 2004),是我国北方逆境土壤(干旱、瘠薄、盐碱化等)种植的重要杂粮作物之一(张永清等 2009)。赤小豆在改善土地利用率、丰富农副产品多样性、满足人民不断增长的粮食需求、促进农民增收以及扩大市场和出口商品种类等方面均有重要作用(贾德新等 2016)。
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1.2.药食两用赤小豆研究进展
1.2.1 赤小豆种植分布和生长发育规律
赤小豆起源于中国(Liu et al. 2013),并且在世界范围内广泛种植。其中,东亚地区是赤小豆的主要产区(Tomooka et al. 2005)。赤小豆是我国的传统杂粮作物之一,目前我国收集的赤小豆种质有 4000 多份,多数为栽培种极少为野生种(胡家蓬 1999)。赤小豆产区主要分布在华北、东北、西北地区、黄河流域、长江流域和华南地区,每年产量约为 20~40 万 t(李艳霞 2015)。近年随种植业结构调整,国内小豆种植面积逐步增加至 30 万 hm2(王丽侠等 2013)。
赤小豆喜温、喜肥、抗旱,根系比较发达,生长期短,栽培模式灵活,土壤适应性强,适合夏季播种。赤小豆生育期一般在 80~90 d 左右,可分为苗期、分枝期、开花期、结荚期和鼓粒期 5 个生育时期(董伟欣等 2018)。赤小豆株高一般在 50~70 cm,植株形态可分为直立型、半蔓生型和蔓生型,其花、荚主要分布于植株中、下部(金文林等 1993)。
赤小豆属于豆科植物。具有很强的固氮能力。种植赤小豆可以减少氮肥用量,故赤小豆可作为荒地培肥的先锋植物(王中林 2019;张晓红等 2017)。赤小豆的产量受播种时期、水肥、病害以及种植密度等多种因素的影响。因此要合理种植,以提高赤小豆的种质及栽培质量。
1.2.2 赤小豆的保健和药用价值
赤小豆在我国的食用及药用历史悠久。赤小豆富含淀粉、蛋白质、钙、铁和B 族维生素等多种营养成分以及多酚、单宁、鞣质、皂苷、黄酮等多种生物活性物质,食用和药用价值都比较高(钟华 2005;2012;彭游等 2013)。赤小豆味甘、酸,性平,无毒,归心、小肠经。具有利尿、消肿、通乳、除热痹、消疮毒、补血健脾的功效(马瑞萍等 2012),临床上常用于水肿胀满,脚气肢肿,黄疽尿赤,风湿热痹,痈疮疖毒,肠痈腹痛等病症。赤小豆在中医临床中应用已有上千年,且在我国传统医学著作中有所记载。《伤寒论》中多处记载赤小豆的应用,如“发汗解表,宣发郁热之证,用麻黄连翘赤小豆汤”(熊曼琪 2000);李时珍(2013)的本草纲目中也有记载赤小豆“治恶毒,散恶血,除烦满,通气,健脾胃,令人美食”。赤小豆在现代药理学研究上表现出了出色的抗氧化、降血糖、降血脂能力(Lin et al. 2001;Itoh et al. 2009;Chi et al. 1999)。宁颖等(2013)通过多种色谱分离方法,从赤小豆 70%  乙醇提取物中分离得到刺五加苷、白藜芦醇和麦芽酚等 8 个化合物,麦芽酚为首次从该种植物中分离得到。陈俏等(2017)在赤小豆乙醇提取物的乙酸乙酯部位分离得到 12 种化合物,包括儿茶素、槲皮素、没食子酸乙酯以及丙二醇等物质,没食子酸乙酯以及丙二醇为首次从豇豆属植物中分得。
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第二章  PEG 胁迫下药食两用赤小豆幼苗叶片叶绿素含量和水分状况的变化


2.1 材料与方法
2.1.1 试验材料
试验材料选取两种药食两用赤小豆品系 XD13-12 和 XD15-03,均属于晚熟品种,抗倒伏性较好。品系 XD15-03 主茎分枝数、主茎节数多。品系 XD13-12 株高略高,单株荚数、荚长、荚粒数及百粒重更大,产量性状优于 XD15-03。赤小豆种子由西北农林科技大学农学院王鹏科副教授惠赠。
2.1.2 试验设计
挑选均匀饱满的赤小豆种子,用 70%  乙醇消毒 30 min。倒掉乙醇后用蒸馏水冲洗干净。将滤纸铺放在培养皿中,加适量蒸馏水浸湿。将消毒的种子移至培养皿中,等待其发芽,此阶段注意避光。发芽的种子移到蓬松的沙子中继续培养,待其地上部分长至 5cm 高时移到漂浮板上水培培养。种子发芽及砂培期间定时喷洒蒸馏水使其保持湿润。砂培和水培阶段均在在光照培养箱中进行。培养条件:22℃的昼夜温度,16 h/8 h 的光周期,180 µmol m-2 s-1的光照强度。每 2 d 更换一次 1/2 Hoagland 营养液。待其生长至两周龄时用含有 20% PEG6000 的  1/2 Hoagland 营养液处理幼苗,共处理 48h,在 PEG 处理后的 0、6、12、24 和 48 h 采赤小豆幼苗叶片用于后续指标的测定。
图 2-2 赤小豆幼苗叶片相对含水量变化
图 2-2 赤小豆幼苗叶片相对含水量变化
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2.2 测定指标及方法
2.2.1 赤小豆幼苗叶片失水率的测定
叶片失水率的测定参考取 Clarke 等人(1989)的方法,取正常生长条件下的赤小豆幼苗叶片,放置到滤纸上,室温中静置,每 1  h 测定一次叶片的重量,共测至 12 h,计算其失水率。每个品种 3 个生物学重复。
2.2.2 赤小豆幼苗叶片相对含水量(RWC)测定
在 PEG 处理后 0、6、12、24 和 48 h 取赤小豆幼苗叶片。RWC 根据 Smart 等人(1974)的方法进行测定。采样后先称量样品的鲜重(Wf)。然后用蒸馏水浸泡样品 4 h。擦干水分后称量样品的重量,即饱和重量(Wt)。最后在 85℃的条件下将样品烘干至恒重,并称量记录干重(Wd)。RWC 计算如下:RWC [%] =(Wf-Wd)/(Wt-Wd)×100%。每个处理 3 个生物学重复。
2.2.3 赤小豆幼苗叶片叶绿素含量测定
在 PEG 处理的 0、6、12、24 和 48 h 采赤小豆幼苗叶片的新鲜样品。用 10 mL 80% 的丙酮浸提剪碎的样品。避光浸提至无色,测定其吸光度 A645、A 663。叶绿素含量的计算参照 Lichtenthaler(1987)的方法。每个处理 3 个生物学重复。
2.2.4 数据统计与分析
通过 Excel2010 及 SPSS22.0 统计分析软件进行数据分析,采用 Duncan 多重比较对数据进行差异显著性检测,显著水平设置为 P<0.05。
图 2-1 赤小豆幼苗叶片失水率变化
图 2-1 赤小豆幼苗叶片失水率变化
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第三章  药食两用赤小豆幼苗叶片抗氧化系统对 PEG 胁迫的响应 .......... 13
3.1 材料与方法 ..................................... 13
3.1.1 试验材料 ........................... 13
3.1.2 试验设计 ....................... 13
第四章  PEG 胁迫对药食两用赤小豆幼苗生长的影响 .................... 21
4.1 材料与方法 ................................................. 21
4.1.1 试验材料 ............................................. 21
4.1.2 试验设计 ............................................. 21
第五章  PEG 胁迫下药食两用赤小豆幼苗总类黄酮及总酚含量的变化 ...... 26
5.1 材料与方法 .............................. 26
5.1.1 试验材料 ........................... 26
5.1.2 试验设计 ............................................. 26

第五章  PEG 胁迫下药食两用赤小豆幼苗总类黄酮及总酚含量的变化

5.1测定指标及方法
TPC 和 TFC 提取物的制备参考 Sumczynski(2015)等人的方法。将 0.05 g 干燥样品和 6 mL 甲醇混合,置于 40℃的声波浴中 1 h。声波浴结束后,向混合物中加入 2 mL 4 M NaOH。室温黑暗条件下,在摇床上以 220r/min 摇动 12 h,以水解固体残余物。混合液 12,000 g 离心 20min。取上清液用于后续的实验。每个处理 3 个生物学重复。 
TPC 通过福林酚方法来测定(Yesil et al. 2007)。将 0.5 mL 的样品提取液和5 mL 的蒸馏水混合,然后加入 0.5 mL 的福林酚试剂。混合物静置平衡 5 min。向混合物中加入 1.5 mL 的 20%NaCO3 ,涡旋混匀。静置反应 30 min。用可见分光光度计测定 765 nm 处的吸光值。以没食子酸为标准品,制作标准曲线。以每克干重当中没食子酸(GAE)的毫克数(mg GAE / g DW)来表示 TPC 的含量。
通过比色法测定 TFC(Kulkarni et al. 2014)含量。取 3.0 mL 的提取液,向其中加入 0.375 mL 的 0.5 M NaNO2和 3.0 mL 的 20 %  乙醇,混匀。静置 5 min,向混合物中加入 0.375 mL 的 0.3 M AlCl3·  6H2O 溶液。混匀后再次静置 5 min。最后加入 2.5 mL 的 1 M NaOH。反应 10 min 后测定其在 506 nm 处的吸光值。以芦丁作为标准品,构建标准曲线。最终以每克干重中的芦丁(RE)毫克数(mg RE / g DW )来表示 TFC  的含量。
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第六章  结论与展望

6.1 结论
选用 XD13-12 和 XD15-03 两种药食两用赤小豆,采用 PEG 模拟干旱胁迫,测定赤小豆幼苗叶片总类黄酮、总酚类物质含量和抗氧化酶活性等生理指标,探究 PEG 胁迫下赤小豆幼苗叶片水分状况与抗氧化之间的变化规律,获得主要结论如下:
(1)PEG 胁迫下品系 XD15-03 水分状况和光合优于 XD13-12。随着胁迫时间延长,两品系赤小豆幼苗叶片 RWC 均呈下降趋势,品系 XD13-12 RWC 下降幅度大于 XD15-03。室温下两品系的叶片失水率在离体的 0-12  h 内不断上升,品系 XD13-12 失水率始终大于 XD15-03,品系 XD15-03 具有较强的保水性。PEG胁迫导致赤小豆幼苗叶片中叶绿素的降解,品系 XD13-12 和 XD15-03 的叶绿素含量随胁迫时间延长不断降低,且 XD13-12 降幅大于 XD15-03。
(2)PEG 胁迫下品系 XD15-03 抗氧化能力强于 XD13-12,具有更好的活性氧清除能力。PEG 胁迫下赤小豆幼苗叶片中 O2- 和 H2O2 含量呈上升趋势,活性氧在品系 XD13-12 积累量较高。品系 XD13-12 叶片中 MDA 含量高于 XD15-03,其细胞脂质过氧化和膜损伤程度更严重。活性氧大量积累,相应的抗氧化酶活性有不同程度增加,品系 XD15-03 叶片抗氧化酶活性的增幅大于 XD13-12。PEG胁迫下品系 XD15-03 叶片中脯氨酸含量增幅大于 XD3-12,有助于提高赤小豆对干旱胁迫的耐受性。PEG 胁迫下品系 XD15-03 抗氧化能力更优。
(3)PEG 胁迫下两品系赤小豆幼苗生长均受到抑制,品系 XD13-12 生长受PEG 胁迫影响相对较大。胁迫 48  h,品系 XD13-12 根长、地上部分鲜重、干重以及总生物量均显著下降。XD15-03 株高和地上部分显著出现显著差异。可溶性蛋白和可溶性糖在干旱胁迫下含量增加,维生素 C 含量不断下降,XD13-12 降幅大于 XD15-03。品系 XD15-03 对 PEG 胁迫耐受性更强。
(4)PEG 胁迫下两品系赤小豆幼苗叶片总类黄酮含量呈先升后降的趋势,品系 XD13-12 降幅大于 XD15-03;胁迫 48 h,品系 XD13-12 总酚含量下降,品系 XD15-3 总酚含量略高于对照。表明品系 XD15-03 中类黄酮和酚类等活性物质积累量较高。
参考文献(略)