三酶级联转化L-苯丙氨酸生产D-苯丙氨酸的探讨

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论文字数:31256 论文编号:sb2021102714414239170 日期:2021-11-02 来源:硕博论文网
本文是一篇药学论文,本研究的主要结论如下: (1) 成功构建了三酶级联催化 L-苯丙氨酸生产 D-苯丙氨酸的路径:筛选了催化活力较高的 Proteus mirabilis 来源的 L-氨基酸脱氨酶突变体(PmL AAD)、Proteus vulgaris 来源的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(Pv DAPDH)以及 Bacillis megaterium 来源的葡萄糖脱氢酶(BmG DH)。体外构建三酶级联反应并通过液相、质谱、核磁对产物鉴定验证了该路径的可行性。测定不同浓度下三个酶对转化L-苯丙氨酸生成D-苯丙氨酸初速度的影响,确定限速酶为 Pv DAPDH。

第一章  绪论

1.1 D-苯丙氨酸的概述
1.1.1 D-苯丙氨酸的简介
D-苯丙氨酸(D-Phenylalanine,D-Phe),又名(R)-2-氨基-3-苯基丙酸,是一种非蛋白α-氨基酸。它的相对分子质量为 165.19,化学式为 C9H11NO2。α-C 原子上的手性为 R-构型,结构上与 L-苯丙氨酸互为对映异构体(图 1-1)。D-苯丙氨酸为白色至灰白色粉末物质,熔点为 273 oC,易溶于水(27 g·L-1,20 oC),微溶于甲醇及乙醇,不溶于乙醚;常温下较稳定。
图 1-1 DL-苯丙氨酸的结构比对
图 1-1 DL-苯丙氨酸的结构比对
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1.2  酶法制备D-苯丙氨酸的研究现状
D-苯丙氨酸的生产方法可分为三类:化学法[16]、发酵[17]法与酶法[4]。化学法不对称合成 D-苯丙氨酸,需采用手性试剂,然而这些手性试剂价格昂贵、来源有限,且反应的步骤长、能耗大,反应条件剧烈、污染大,最终产物的光学纯度也很低,因此难以实现大规模的生产。此外,D-型氨基酸属于非天然氨基酸,故采用发酵法制备也较为困难,最终产品的光学纯度和产率也都较低[18]。相比之下,酶法具有立体选择性高、反应条件温和、操作简单且环保等优点,因此它在工业生产中具有很好的应用前景[19];当前,酶法制备 D-苯丙氨酸主要有以下四种途径(图 1-3):(A)  海因酶途径、(B)  转氨酶途径、(C) 外消旋体的拆分、(D)  不对称还原胺化。
1.2.1  海因酶途径
海因酶途径是工业上一个经典的动态动力学拆分(dynamic kinetic resolution,DKR)的多酶级联过程,包含了海因消旋酶(Hydantoin  racemase,HRase)、D-海因酶(D-hydantoinase,DHHase,EC 3.5.2.2,又名乙内酰脲酶)、以及 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(N-carbamoyl-D-amino acid amidohydrolase,DCHase,简称氨甲酰水解酶)三个酶[20]。如图 1-3(A)所示,在这一系统中,L-或 D-型的海因作为底物,首先在 HRase 的作用下外消旋化产生 D-海因;然后产生的 D-海因会被 D-特异性的 DHHase 水解成 D-N-氨甲酰-D-氨基酸;最后,N-氨甲酰-D-氨基酸又会在 DCHase 的作用下发生水解最终形成 D-氨基酸。Nozaki 等人通过在大肠杆菌中同时表达这三个酶,并采用全细胞进行催化,成功制备了 D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸等 8 种 D-氨基酸;其中,D-苯丙氨酸在 48 h的浓度达到 45.9 g·L-1,且具有 99% ee[21]。
虽然该路线成本较低、工艺流程简单,但它在工业应用上依旧存在着一些问题:如海因底物在水中的溶解度小,氨甲酰水解酶的可溶性表达差、易氧化失活、热稳定性差以及三个酶反应条件不兼容等,成为转化过程中的限制性因素。因此,发掘具有高立体选择性、高可溶性表达且具兼容性的氨甲酰水解酶,建立一个高效的 DKR 级联过程对D-氨基酸的生产十分关键。为此,王胜锋等人通过在原有苄基海因水解工艺的基础上增加了海因消旋酶的投入,同时优化转化温度,以固定化的三种酶催化 30 g·L-1 的 L-5-苄基海因转化,实现 D-苯丙氨酸 90.4%的收率[19]。此外,倪晔课题组通过对基因组进行挖掘,成功筛选到来源于成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)的氨甲酰水解酶 Ac HyuC,该酶具有较高的对映选择性和活性,蛋白高可溶性表达且兼容反应条件;将其引入级联反应,D-色氨酸的生产能力能达到 36.6 g·L-1·d-1[22]。通过这种动态动力学拆分过程,许多 D-氨基酸能够以工业级规模进行合成,具有 100%的理论转化率及较高的立体选择性,是实现 D-氨基酸经济且高对映选择性合成的一个有前景的策略。
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第二章  材料与方法

2.1  实验材料
2.1.1  菌株和质粒
本研究中使用的主要菌株和质粒见表 2-1。
表 2-1  主要菌株和质粒
表 2-1  主要菌株和质粒 
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2.2  分子基本操作
2.2.1  基因组、质粒的提取以及产物的回收
(1)  细菌 DNA 的提取
将购买的含有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的野生菌株培养活化后,收集菌体,使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒(天根生化科技股份公司)抽提基因组。
(2)  质粒的提取、产物胶回收
采用相应的商品化试剂盒(生工生物工程有限公司),按照说明书的操作步骤提取质粒、回收产物。
2.2.2  感受态的制备与转化
(1)  感受态的制备:氯化钙法。
(i)  挑取 E. coli BL21(DE3)的单菌落至无抗 LB 培养基中,37 oC 过夜培养;
(ii)  将培养后的种子液按 1%的接种量转接到新的 50 mL 无抗 LB 培养基中,于 37 oC 下培养 2-3 h,至其 OD600 值达到 0.4-0.6;
(iii)  将所得菌液置于冰上冰浴 15 min 后,倒入提前灭菌且预冷的 50 mL 离心管中,4 oC、5000 rpm 离心 5 min,弃去上清;
(iv)  于弃去上清的 50 mL 离心管中加入 20 mL 灭菌且预冷的 0.1 M CaCl2 溶液,用5 mL 枪吹吸使菌体重悬,冰浴 15-30 min。冰浴后,菌液于 4 oC、5000 rpm 条件下离心5 min,弃去上清;
(v)  在上述弃去上清的离心管中加入 1 mL 30%甘油和 1 mL CaCl2 溶液,反复吹吸使菌体重悬;将重悬菌液按每管 100 μL 分装于提前灭菌且预冷的 1.5 mL EP 管中,于-80 oC 冰箱保存、备用。
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第三章   结果与讨论 .................................................. 25
3.1 D-苯丙氨酸合成路径的设计与构建 ..................................... 25
3.1.1  路径的设计 ............................................... 25
3.1.2  酶的筛选及重组菌的构建 ............................................ 25
3.1.3  路径的体外验证 .................................................. 27
主要结论与展望 ............................... 44
主要结论 ................................... 44
展望 ...................................... 45

第三章  结果与讨论

3.1 D-苯丙氨酸合成路径的设计与构建
3.1.1  路径的设计
D/L-苯丙氨酸(D/L-Phe)在结构上互为对映异构体。从 L-苯丙氨酸出发,通过级联反应对 α-碳原子上的手性进行重置可以生产 D-苯丙氨酸[58-60]。如图 3-1 所示,该反应分为两步:(i) L-苯丙氨酸经过 L-氨基酸脱氨酶(LAAD)的氧化脱氨作用生成苯丙酮酸(PPA);(ii)  苯丙酮酸经过内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-DAPDH,简称 DAPDH)的还原胺化作用生成 D-苯丙氨酸,该过程需偶联葡萄糖脱氢酶(GDH)用于辅因子 NADPH 的再生。通过 LAAD、meso-DAPDH 和 GDH 联用,可以实现一锅法转化 L-苯丙氨酸制备 D-苯丙氨酸。
图 3-1  级联反应催化 L-苯丙氨酸生产 D-苯丙氨酸的路径设计
图 3-1  级联反应催化 L-苯丙氨酸生产 D-苯丙氨酸的路径设计
3.1.2  酶的筛选及重组菌的构建
基于实验室先前的改造研究,选择了奇异变性杆菌(Proteus mirabilis)来源的 L-氨基酸脱氨酶突变体(PmL AAD)[61]用于 L-苯丙氨酸的氧化脱氨,该突变体对 L-苯丙氨酸具有较高的催化活性(比活力为 0.12  U·mg-1)。基于文献的报道,选择了巨大芽孢杆菌(Bacillis megaterium)来源的葡萄糖脱氢酶(BmG DH)[62]用于辅因子 NADPH 的再生(比活为 8.25 U·mg-1)。对于内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶,则以 St DAPDH (PDB ID: 3WBF)为参考,在 NCBI 数据库上选择 7 种不同来源的野生型 meso-DAPDH (序列相似度为30%~70%),通过在 E. coli 中异源表达及测定酶活,最终确定 DAPDH 的最适酶源,从而实现级联路径的构建。
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主要结论与展望

主要结论
本研究以 L-苯丙氨酸为底物,通过三酶级联反应催化 L-苯丙氨酸生产 D-苯丙氨酸。首先对级联路径进行设计、验证,找出限速酶(Pv DAPDH)。其次,在对接分析的基础上对限速酶进行蛋白质工程改造,提高 Pv DAPDH 的催化活性。最后将 Pv DAPDH 突变体与 LAAD、GDH 共表达,并通过体外酶活比例的优化指导体内的优化,实现了 D-苯丙氨酸的高效生产。本研究的主要结论如下:
(1) 成功构建了三酶级联催化 L-苯丙氨酸生产 D-苯丙氨酸的路径:筛选了催化活力较高的 Proteus mirabilis 来源的 L-氨基酸脱氨酶突变体(PmL AAD)、Proteus vulgaris 来源的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(Pv DAPDH)以及 Bacillis megaterium 来源的葡萄糖脱氢酶(BmG DH)。体外构建三酶级联反应并通过液相、质谱、核磁对产物鉴定验证了该路径的可行性。测定不同浓度下三个酶对转化L-苯丙氨酸生成D-苯丙氨酸初速度的影响,确定限速酶为 Pv DAPDH。
(2) 从张力释放的角度对 Pv DAPDH 进行半理性改造以提高 Pv DAPDH 的催化活力:首先,底物谱分析表明 Pv DAPDH 具有较为宽泛的底物谱、较高的对映选择性、然而较低的催化活性,有待于被改造。对 Pv DAPDH 同源建模以及对接分析,发现非天然底物苯丙酮酸侧链上的张力可能是造成活性较低的原因:一方面来源于空间位阻,另一方面来源于 pi-pi 作用的牵拉。针对这两点,我们提出了张力释放策略:通过扩大底物结合口袋,并消除阻碍催化的牵引力,最终获得了一个三突变体 Pv DAPDHW121A/R181S/H227I,比活由 0.08 提升至 6.86 U·mg-1,提高了 85 倍。催化效率(kcat/KM)由 0.038 提高至 2.43       s-1·mM-1,提高了 64 倍。此外,最优突变体对其它三种大体积酮酸底物的催化性能也有较大提升。对接分析突变前后口袋的变化,发现口袋体积的增加(244 Å3↑),以及还原氢转移距离的缩短(4.1Å→3.9 Å)是酶的催化性能得以提高的分子机制。
参考文献(略)