基于PI3K/Akt/mTOR自噬通路探讨人参皂苷Rg1延缓D-gal诱导的卵巢早衰小鼠模型卵巢早衰的机制

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论文字数:38856 论文编号:sb2021112110085639731 日期:2021-12-03 来源:硕博论文网
本文是一篇医学论文,笔者经过研究,得出以下结论:1 Rg1 可以延缓 D-gal 诱导的 POF 小鼠模型卵巢的早衰。2 Rg1 可通过调控 PI3K/Akt/mTOR 自噬通路延缓 D-gal 诱导的 POF 小鼠模型卵巢的早衰。

实验材料

1 实验动物
选取购买于昆明医科大学实验动物中心,安全证书编号为 SYXK(滇)k2015-0002 的SPF 级雌性 BALB/c 小鼠,共 54 只,具体要求是体重在 21.61.7g 之间,周龄:6-8 周之间。
(1)人参皂苷 Rg1 配液:取 10 瓶分子量为 801.1 KD 的人参皂苷 Rg1 共 200 mg,加入 PBS 缓冲液,配置成母液 20 mg/mL,过滤灭菌后,加入适量 PBS 缓冲液把浓度调整到 2mg/ml,4ml/每管,分装到其他无菌离心管中,贴上密封膜,写好溶液浓度及名称、姓名和日期,存放于 4 ℃冰箱内。
(2)D-gal 半乳糖溶液配制:在 4g D-gal 干粉中加入 40 ml PBS 缓冲液,搅拌直到完全溶解后,继续加入 PBS 缓冲液直到总体积为 100 ml,过滤除菌,以每管 3 ml 量装入其他消毒过的干净离心管中,写好溶液浓度及名称、配置者姓名和配置日期等信息,存放于 4 ℃冰箱内。
(3)PBS 配液:在 800 mL 的蒸馏水加入一袋 PBS 干粉,搅拌直到完全溶解后,定容到 1 L,完成高压灭菌后,贴上密封膜,写好溶液浓度及名称、配置者姓名和配置日期等信息,存放于 4 ℃冰箱内。
(4)PMSF(10 mmol/L )的配液:按照下表的要求将试剂加入 150 mL 烧杯中,然后搅拌直到完全溶解,运用 2 mL EP 管完成分装,写好溶液浓度及名称、姓名和日期,存放于-20 ℃冰箱内。
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2 实验试剂
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实验方法

1 实验分组
BALB/c 小鼠购入后,在通风良好清洁无菌的环境中喂养 7 天,让小鼠适应新的环境,然后使用随机分组方法,把小鼠分成 3 组,18 只/组,开始药物干预。PBS 组(即对照组):将等量 PBS 注射入小鼠颈背部皮肤下,连续注射 42 d,第 15 天开始腹腔注射等量等时 PBS 溶液,共 28 d。D-gal 组(即模型组):把 D-半乳糖注射在小鼠颈背部皮下,给药剂量为 200 mg/kg/d,注射 42 d,第 15 天开始腹腔注射等量等时 PBS 溶液,共 28 d。Rg1 组(即实验组):把 D-半乳糖注射在小鼠颈背部皮下,给药剂量为 200 mg/kg/d,注射 42 d,在第 15 天的时候开始同时按每公斤体重每天注射 20 mg 人参皂苷 Rg1 的剂量进行腹腔注射人参皂苷 Rg1 溶液,连续注射 28 d。
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2.基本情况的观察和体质量的测量
实验开始后每天都进行给药处理,但隔天称重一次,在给药和称重的过程中观察小鼠的运动、进食、排便以及毛发。
每天 8:30 AM 开始进行阴道涂片,具体操作方法:一手抓住小鼠颈背部的皮肤牢牢固定住小鼠,另一手用灭菌棉签蘸取少量 NaC L 溶液后插入小鼠阴道内,缓慢捻转一到两圈,完成后涂抹棉签上的分泌物到载玻片上,静置晾干。使用伊红-苏木素染色:
1)10%多聚甲醛滴在载玻片的分泌物上固定 15 分钟,风干;2)滴加苏木素后,开始计时 10 min,对细胞核进行染色,时间到后流水清洗;3)滴加含有 1%HCL 的酒精,1 s 后快速流水冲洗;4)滴加伊红,浸染 30 s,进行细胞质的染色;5)流水冲洗;6)晾干后使用中性树胶完成封片;7)使用显微镜观察结果,根据涂片中脱落细胞的形态及种类来判断小鼠的具体动情周期,记录每组 6 只小鼠动情周期变化的情况。
通过观察阴道分泌物中存在细胞类型分析判断动情周期:动情期:主要特征是片状无核角化上皮细胞最多;动情前期:有核的椭圆形上皮细胞在主导地位;动情间期:白细胞成为最大的亮点;以上三种类型细胞都存在的就是动情后期。
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实验结果........................................23
1 人参皂苷 Rg1 对小鼠体质量增长率的影响................................ 23
2 阴道脱落细胞观察动情周期.................................23
3 人参皂苷 Rg1 作用后小鼠卵巢质量系数的变化................................... 25
4 人参皂苷 Rg1 对小鼠血清性激素的影响.............................................. 2
65 人参皂苷 Rg1 对小鼠血清抗氧化酶的影响................................... 27
讨论.................................36
结 论...........................45


讨论


40 岁前年轻女性发生卵巢病变,表现月经稀少或提前闭经,产生不孕不育和更年期症状表现称为 POF,对妇女身心健康产生严重的影响[23]。POF 的发生导致女性雌激素分泌出现紊乱,长期雌激素分泌不足导致患者出现焦虑、抑郁等神经症状,同时对于未生育的女性来说,给患者带来更为致命的打击是不孕。目前尚不清楚 POF 发并机制,医学家推测可能与年龄、遗传、环境、行为学、医院性 、病理性、社会心理等因素息息相关[24]。研究表明[25,26],卵巢早衰出现生育能力下降的主要原因有两个,一个是没有发育成熟的卵泡,另一个是卵泡对激素的作用不敏感,激素不能促进卵泡的发育。临床上对于不孕的治疗主要采用的是赠卵这一种辅助生殖技术。但费用不菲,成活率较低,给患者造成巨大的心理压力,更为重要的是所诞生的婴儿不含有 POF 患者的任何遗传信息,因而只有少部分的患者会接受这样的治疗方式。针对雌激素缺乏导致的各种症状多采用激素替代疗法进行治疗,症状改善明显,但长期服用激素的后遗症更明显,更严重的是会带来一定的癌变风险[27],停药后容易复发,甚至卵巢功能更加衰竭。因此寻找能负向调控卵巢早衰又对机体有正向调控作用的药物是卵巢早衰靶向药物研究的新思路。
作为中医治疗的主要手段之一的中药材,有几千年的传承,是天然药物成份的主要提取材料,具有注重整体,协调阴阳的优势且毒副作用小。在中药材中寻找一种有效治疗 POF 的活性成份已经成为近年来研究新思路。“血枯”,“闭经”,“不孕”等全都是中国传统医学中卵巢早衰的范畴[28],在中医的理论中,卵巢早衰的首要原因有两个,一个是肾虚,还有一个是天葵枯竭,治疗最基本原则是滋阴、补肾、填精[29]。人参具有补肾、补气、生津、复脉固脱,固本培元、平衡阴阳的优势。人参中存在许多具有治疗效果的人参皂苷单体,在所有的人参皂苷单体中人参皂苷 Rg1 是研究最为充分的单体之一。研究表明[30],Rg1 能够抵抗老化、能够清除超氧负离子抵抗氧化,通过促进 DNA复制、RNA 转录和翻译、合成蛋白质,提高毛细血管再生能力、对抗细胞的凋亡,实现机体免疫力的强化,被称为天然的 E2。因此我们考虑选用人参皂苷 Rg1 作为治疗药物。
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结论


1 Rg1 可以延缓 D-gal 诱导的 POF 小鼠模型卵巢的早衰。
2 Rg1 可通过调控 PI3K/Akt/mTOR 自噬通路延缓 D-gal 诱导的 POF 小鼠模型卵巢的早衰。
参考文献(略)